首页 > 文献资料
-
周期型马来丝虫HSP70基因原核表达载体的构建及表达产物的分析
目的 在大肠埃希菌宿主系统中表达周期型马来丝虫热休克蛋白70(HSP70)基因,并对表达产物进行SDS-PAGE分析.方法 以重组质粒pGEM-T-HSP70为模板,根据报道的HSP70基因序列设计合成一对引物,用PCR法扩增HSP70基因(包括完整开放读码框架片段及其上下游序列共长2 198 bp),PCR产物定向插入原核表达载体pGEX-4T-3中,构建的重组质粒pGEX-4T-3-HSP70经双酶切鉴定.将重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),用IPTG诱导GST.Tag融合蛋白的表达,经SDS-PAGE分析并经凝胶图像分析确定目的 蛋白的表达水平.结果 重组表达质粒pGEX-4T-3-HSP70全长约7 200 bp,经双酶切后应得到长度为4 968 bp的载体和2 198 bp的目的 基因2个片段,1%琼脂糖凝胶电泳显示结果同预期完全相符.HSP70相对分子质量(Mr)为70×103,质粒pGEX-4T-3的融合部分(GST.Tag)表达产物的Mr约为26×103,将重组质粒转化BL-21(DE3)菌,经IPTG诱导表达,菌体蛋白的SDS-PAGE图谱显示,诱导组出现特异性蛋白表达条带,其Mr约100×103,与预计大小相同.目的 蛋白占菌体总蛋白的12%左右.结论 成功地构建了重组原核表达载体pGEX-4T-3-HSP70:周期型马来丝虫HSP70基因可在大肠埃希菌中稳定表达,为制备和纯化表达蛋白以及丝虫病疫苗的进一步研究打下基础.
-
周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因的克隆与真核表达
目的 克隆和表达周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶(BmGAPDH)的编码基因.方法 依据公布的BmGAPDH基因序列设计引物,以周期型马来丝虫总RNA为模板,反转录PCR(RT-PCR)扩增目的 编码基因.PCR产物经TA克隆后,克隆至载体pGEM-T Easy中,经PCR和双酶切鉴定后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/BmGAPDH,转染COS-7细胞后进行RT-PCR验证.用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)对获得重组蛋白(rBmGAPDH)进行分析和鉴定.结果 转染的COS-7细胞高水平表达BmGAPDH的mRNA,根据克隆的目的 基因序列推导的氨基酸序列与GenBank登录的结果 一致.SDS-PAGE分析显示重组蛋白rBmGAPDH相对分子质量(Mr)约为43 000.结论 成功进行了BmGAPDH编码基因的克降和真核表达.Cloning,weukaryotic expremion of the gene encoding glyceraidehydes-3-phosphate dehydrogenase from periodic Brugia malayi XIE Dong-fimg,FANG Zheng,HUANG Wei-qun,SHEN Qin,TONG Hai-yan,XUBang-sheng.
关键词： 周期型马来丝虫 3-磷酸甘油醛脱氢酶 真核表达载体 COS-7细胞 -
周期型马来丝虫副肌球蛋白基因真核表达重组质粒构建
提取周期型马来丝虫总RNA.跟据已知的马来丝虫副肌球蛋白(BmPmy)基因序列,设计合成引物,并引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位点,应用RT-PCR技术,扩增BmPmy基因片段,克隆至载体pGEM-T中,经PCR和双酶切鉴定后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+),成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)-BmPmy,并转染COS-7细胞后进行RT-PCR分析.转染的COS-7细胞高水平表达周期型马来丝虫副肌球蛋白mRNA,结果与预期相符.
-
表达马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的Hela细胞的无血清培养
目的：使用无血清培养基培养可稳定表达马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因(Brugia malayi cystatin， Bm-CPI)的人宫颈癌细胞(Hela)。方法：将已获得的Bm-CPI稳定转染的Hela细胞株，进行无血清培养并观察Hela细胞的维持时间和培养过程中Hela细胞的形态变化。结果：无血清培养基培养Hela细胞可维持细胞的正常生长。结论：无血清培养基可以逐步代替含血清的培养基，为后续Hela细胞扩大培养和Bm-CPI基因重组蛋白纯化提供依据。
关键词： 周期型马来丝虫 半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因 无血清培养 -
我国周期型马来丝虫六个省区虫株氨基酸的比较分析
目的本实验进行丝虫种内分类学研究探讨我国六个省七个不同地区马来丝虫是否存在种内的生物学特性差异.方法采用HPLC对贵州独山株、贵州荔波株、四川乐山株、湖北谷城株、安徽泾县株、浙江安吉株、福建建阳株马来丝虫成虫的18种虫体氨基酸含量及种类进行分析比较.结果七个地区马来丝虫虫体氨基酸的总含量经统计分析无明显的差异(P＞0.05),碱性氨基酸、酸性氨基酸以及芳香族氨基酸亦无明显的差异(P＞0.05),但在一些种类的氨基酸含量高低和个别氨基酸的缺如有一定的差异.结论七个虫株丝虫虽有微小的生物学差异,但目前尚未发现有明显的种内分化的迹象.
-
RAPD比较分析我国四省区周期型马来丝虫DNA的多态性
本文采用RAPD技术对我国湖北古城、贵州独山、福建建阳和安徽泾县四个地区的周期型马来丝虫成虫基因组DNA的多态性进行扩增分析.结果显示:四个地区马来丝虫基因组DNA扩增产物出现有3条相同条带,多条不同条带,其中湖北古城、福建建阳和安徽泾县三地区马来丝虫株所扩增出的条带极为相似,而贵州独山株马来丝虫扩增出的特异性条带较多.表明这四个地区虫体基因具有明显的同源性,但也存在一定差异.从而进一步证实了我国不同地区周期型马来丝虫出现有种内分化的迹象.
-
周期型马来丝虫基因稳定转染细胞株的建立
目的 将含周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Bm-CPI)基因的重组质粒pcDNA3.1(+)-Bm-CPI转染人宫颈癌细胞(Hela细胞)获得重组质粒稳定转染细胞株,为重组蛋白的获得提供基础.方法 将成功构建的重组质粒pcDNA3.1(+)-Bm-CPI转染Hela细胞,以G418筛选转染细胞,通过RT-PCR和SDS-PAGE鉴定G418筛选后的单克隆抗性细胞株.结果 重组真核表达质粒pcDNA3.1 (+)-Bm-CPI转染Hela细胞后,d14可见G418抗性细胞株开始形成.G418抗性Hela细胞株筛选、扩大培养后RT-PCR扩增出621bp左右的目的条带;SDS-PAGE检测获得了明显的目的条带.结论 实验证实peDNA3.1(+)-Bm-CPI重组质粒被成功转入Hela细胞,并获得稳定表达;为进一步研究Bm-CPI表达、蛋白纯化和测定其生物学活性奠定了基础.
关键词： 周期型马来丝虫 半胱氨酸蛋白酶抑制剂 转染 细胞株 -
周期型马来丝虫复合基因真核表达体系的建立
目的 将含周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶(BmGAPDH)和半胱氨酸蛋白酶抑制剂(BmCPI)复合基因的重组质粒pcDNA3.1(+)-BmCPL/BmGAPDH转染人宫颈癌细胞(Hela)细胞获得复合重组质粒稳定转染细胞株,并纯化所表达的重组蛋白,为研制新型的抗周期型马来丝虫重组蛋白疫苗提供理论及实验依据.方法 将成功构建的pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH和空载体pcDNA3.1(+)分别转染Hela细胞,以G418筛选转染细胞,进而通过RT-PCR和SDS-PAGE鉴定G418筛选后的单克隆抗性细胞株.对阳性克隆进行无血清悬浮培养,收集细胞及其培养液.亲和层析纯化所表达的重组蛋白并通过Western-blotting对纯化的重组蛋白进行生物学鉴定.结果 重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH经转染Hela细胞,G418持续筛选14 d获得稳定表达.表达产物经Western-blotting法鉴定能够与相应的免疫鼠血清反应,相对分子质量Mr约为54×103.结论 成功建立了周期型马来丝虫复合重组质粒pcDNA3.1 (+)-BmCPI/BmGAPDH稳定转染细胞株并获得了相应的重组蛋白.
关键词： 周期型马来丝虫 3-磷酸甘油醛脱氢酶 半胱氨酸蛋白酶抑制剂 复合基因 重组蛋白 -
周期型马来丝虫GAPDH部分编码基因原核及真核表达载体的构建
[目的]构建我国流行的周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶(BmGAPDH)部分编码基因原核和真核表达质粒以及基因序列分析,为进一步的研究奠定基础.[方法]根据GeneBank中马来丝虫GAPDH基因的已知序列设计引物,以周期型马来丝虫总RNA为模板,反转录PCR(RT-PCR)扩增目的编码基因.扩增产物经初步鉴定后将其克隆入pGEM-T载体,转化大肠杆菌(E.coli)DH5α,筛选阳性克隆,进行双酶切及PCR扩增鉴定,获得阳性重组质粒pGEM-BmGAPDH,经测序验证,并进行同源性比较.亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+).构建真核表达戴体pcDNA3.1(+)-BmGAPDH,转染COS-7细胞后进行RT-PCR验证.[结果]RT-PCR扩增出一条约877bp大小的特异性条带,重组质粒双酶切的PCR结果与预期相符,DNA序列分析与GeneBank已知的基因序列同源性为99%.转染的COS-7细胞高水平表达BmGAPDH的mRNA,根据克隆的目的基因序列推导的氨基酸序列与GenBank登录的一致.[结论]成功构建了周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶部分编码基因原核及真核表达载体,为进一步功能研究提供了条件.
关键词： 周期型马来丝虫 3-磷酸甘油醛脱氢酶 真核表达载体 COS-7细胞 -
周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶基因的扩增、克隆及序列分析
[目的]克隆周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease of periodic Brugia malayi,BmCP)基因到原核载体中,测定其序列,为进一步的研究奠定基础.[方法]从周期型马来丝虫虫体中抽提总RNA,以mRNA为模板,采用RT-PCR法体外扩增出BmCP基因序列,扩增产物经初步鉴定后将其克隆入pMD18-T载体,转化大肠杆菌(E. coli)DH5α,筛选阳性克隆,进行双酶切及PCR扩增签定,获得阳性重组质粒pMD18-T-BmCP,经测序验证,并进行同源性比较.[结果]RT-PCR扩增出一条约1 201 bp大小的特异性条带,重组质粒双酶切和以质粒为模板的PCR结果与预期相符,DNA序列分析与GeneBank已知的基因序列同源性为99%.[结论]成功构建了周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶重组质粒pMD18-T克隆载体,为进一步研究该基因的功能提供了条件.
