首页 > 文献资料
-
Smad7在成牙本质细胞系MDPC-23内转化生长因子β信号转导中的作用
目的研究Smad7在成牙本质细胞系MDPC-23内转化生长因子(transforming growth factor-β1, TGF-β)信号转导的作用.方法培养MDPC-23细胞,免疫组化法观察TGF-β1对MDPC-23细胞内Smad7分子定位改变.通过瞬时共转染和报告基因检测方法观察Smad7分子对TGF-β1调控目的基因转录的影响.结果MDPC-23细胞表达Smad7蛋白,主要定位于细胞胞浆,在转化生长因子β1刺激30 min后,Smad7从胞核向胞浆转位聚集.TGF-β1显著诱导p3TP-Lux基础启动子活性.过表达Smad7完全抑制TGF-β1对p3TP-Lux启动子活性的诱导,而过表达Smad7反义cDNA载体则显著促进了TGF-β1对p3TP-Lux启动子活性的诱导.结论在成牙本质细胞系MDPC-23内,Smad7可能作为一种抑制性Smad分子在拮抗TGF-β1信号转导过程中发挥重要的作用.
-
肌切蛋白adseverin对小鼠成牙本质细胞增殖、迁移及矿化作用的影响
目的 通过构建沉默肌切蛋白(adseverin)的成牙本质细胞模型,探索肌切蛋白对成牙本质细胞MDPC-23增殖、迁移及矿化能力的影响.方法 构建沉默表达肌切蛋白的慢病毒载体质粒,转染MDPC-23细胞,获得肌切蛋白沉默表达的稳定转染细胞模型.空载体转染细胞及未转染细胞作为对照组,蛋白印迹法(Western blot)检测肌切蛋白干扰效率,细胞计数(CCK-8)法检测细胞的增殖情况,Transwell小室实验观察细胞迁移率,碱性磷酸酶(ALP)试剂盒及茜素红染色检测细胞矿化差异.采用单因素方差分析对数据进行统计分析,LSD-t检验进行两两比较.结果 成功构建肌切蛋白沉默表达的细胞模型,CCK-8结果 显示沉默肌切蛋白后,MDPC-23细胞的增殖率在48和72 h时分别下降26.8%(F48 h=11.025,P=0.01)和26.5%(F72 h=86.205,P<0.001);Transwell结果 显示,沉默肌切蛋白后,MDPC-23细胞迁移能力降低61.2%(F=6.005,P=0.008);干扰肌切蛋白后MDPC-23细胞ALP活性明显升高,约为空载体组的4倍(ALP干扰组=568.43 U/gprot,ALP空载体组=142.56 U/gprot,ALP空转染组=118.16 U/gprot;F=49.002,P<0.001),矿化结节形成量高于对照组.结论 肌切蛋白可能参与成牙本质细胞MDPC-23的增殖、迁移及矿化过程.
-
小鼠牙本质涎磷蛋白基因启动子的克隆与序列分析
目的克隆小鼠牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)基因启动子片段.方法培养MDPC-23细胞,从培养的细胞中提取基因组DNA,利用设计的上下游引物,进行PCR反应.将扩增得到的DSPP基因启动子片段克隆到pMD18-T载体,酶切鉴定后,进一步进行DNA序列测定.结果酶切结果表明成功构建重组质粒,序列分析结果与国外报道一致.结论成功克隆获得小鼠DSPP基因的启动子片段.
-
MDPG-23细胞内Smad信号途径在转化生长因子β1调控Smad7基因转录中的作用
目的:研究成牙本质细胞系MDPC-23内Smad信号途径在转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)调控Smad7基因转录调控中的作用,从基因转录水平探讨成牙本质细胞内TGF-β调控Smad7基因表达的分子机制.方法:培养MDPC-23细胞,通过瞬时共转染和报告基因检测方法观察Smad蛋白分子对Smad7启动子活性的影响,实验数据采用单因素方差分析.结果:当Smad7启动子(-408 bp至+112bp)荧光素酶活性载体表达在MDPC-23细胞时,其基础启动子活性被TGF-β1显著诱导增加,而骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)对其活性无明显影响.单独过表达Smad1、2、4、5对Smad7启动子活性无明显影响.Smad3过表达显著增强Smad7启动子活性,而Smad3与Smad4共转染进一步增强了Smad3的作用.过表达Smad3突变型载体或Smad3反义cDNA(AS-Smad3)均显著抑制TGF-β1对Smad7启动子活性的诱导作用.结论:在成牙本质细胞系MDPC-23内,TGF-β通过Smad3与Smad4协同调控Smad7基因转录.
-
神经生长因子受体介导的黑色素瘤抗原编码基因同源蛋白对牙髓细胞增殖的影响
目的 探索神经生长因子受体介导的黑色素瘤抗原编码基因同源蛋白(NRAGE)对人牙髓细胞(hDPCs)和小鼠成牙本质细胞(MDPC-23)细胞增殖的影响.方法 重组慢病毒转染细胞稳定敲除hDPCs和MDPC-23的NRAGE表达,体外组织块法原代培养hDPCs和MDPC-23,进而检测NRAGE对hDPCs和MDPC-23的增殖影响.采用CCK-8法分析NRAGE对hD-PCs和MDPC-2细胞增殖的影响,流式细胞术分析NRAGE对hDPCs和MDPC-23的细胞周期分布和细胞凋亡影响.免疫荧光法检测NRAGE和NF-κB的表达和定位,分析NF-κB蛋白表达水平,并用IKK抑制剂处理细胞后,分析细胞周期和细胞凋亡.结果 重组慢病毒转染后NRAGE的mRNA和蛋白水平下降显着.NRAGE敲减后抑制了hDPCs和MDPC-23的增殖活性和凋亡.NRAGE敲减后显示hDPCs的G0G1期滞留显著,而对MDPC-23没有影响.同时,NRAGE敲减后激活NF-κB信号通路.IKK抑制剂可以抑制NRAGE敲除后对hDPCs和MDPC-23的细胞凋亡的抑制作用.结论 NRAGE敲减后抑制牙髓细胞的增殖活性.NRAGE通过NF-κB信号通路调控hDPCs的细胞周期和凋亡.
-
Smads蛋白在成牙本质细胞系MDPC-23中的表达及功能
目的研究Smads蛋白在成牙本质细胞系MDPC-23作为转化生长因子(TGF)β信号分子的作用.方法常规条件下培养MDPC-23细胞,在TGF-β1刺激培养1 h后,观察细胞内Smad分子的定位变化.将Smads真核表达载体分别与报告基因载体p3TP-Lux瞬时共转染至MDPC-23,在TGF-β1刺激培养24h后,裂解细胞,用双荧光素酶报告基因检测系统检测细胞裂解液中的荧光素酶活性.结果MDPC-23细胞表达Smad2和Smad3蛋白分子,主要定位于细胞质,在TGF-β1刺激1h后,Smad2和Smad3从胞质向胞核转位聚集.TGF-β1可诱导p3TP-Lux基础启动子活性,约增加13倍.过表达野生型Smad3蛋白可促进TGF-β1对p3TP-Lux启动子活性的诱导,但是过表达Smad3突变体抑制TGF-β1对p3TP-Lux启动子活性的诱导.和Smad3作用相比,过表达Smad2野生型或突变型蛋白对TGF-β1诱导p3TP-Lux启动子活性无明显影响.结论在成牙本质细胞系MDPC-23内,Smad信号途径存在并参与介导TGF-β1诱导的转录调控.
-
成牙本质细胞系MDPC-23的生物学特性
目的:观察成牙本质细胞系MDPC-23的生物学特性.方法:细胞培养,细胞计数和逆转录多聚酶链反应.结果:MDPC-23为上皮样细胞形态,有多个细胞膜突起,易形成细胞结节,细胞倍增时间少于24 h.在mRNA水平证实MDPC-23表达Ⅰ型原胶原a2、碱性磷酸酶和牙本质涎磷蛋白.结论:MDPC-23保持其成牙本质细胞系的生物学特性.
-
TGF-β1对MDPC-23细胞增殖和细胞周期的影响
目的:研究转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)对成牙本质细胞系MDPC-23增殖和细胞周期的影响.方法:细胞培养,MTT比色测定法和流式细胞仪(flow cytometry,FCM)分析技术.结果:TGF-β1能明显抑制MDPC-23细胞增殖,无剂量依赖性,但呈时间依赖性;FCM结果显示,TGF-β1作用后,MDPC-23细胞G1%升高,而S%显著降低,反映细胞增殖活性的增殖指数PrI值(S+G2M)%增高.结论:TGF-β1抑制成牙本质细胞系MDPC-23细胞增殖和DNA合成.
-
Smad8在成牙本质细胞系MDPC-23内BMP-2信号转导中的作用
目的:观察成牙本质细胞系MDPC-23内Smad8蛋白的表达,以及Smad8蛋白在骨形成蛋白-2(bonemorphogenetic protein-2,BMP-2)信号转导中的作用.方法:免疫组化法观察MDPC-23细胞内Smad8蛋白的表达,以及BMP-2和转化生长因子β1(TGF-β1)对MDPC-23细胞内Smad8分子定位的改变.结果:MDPC-23细胞的胞浆和胞核均有Smad8表达,在BMP-2刺激1 h后,Smad8从胞浆向胞核转位聚集.TGF-β1刺激后无类似现象发生.结论:成牙本质细胞系MDPC-23内存在Smad8的表达,且Smad8可特异性地将BMP-2的信号由胞浆转至胞核,但不能转导TGF-β1信号.
-
FGF18对成牙本质细胞样细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响
目的:研究FGF18对成牙本质细胞样细胞MDPC-23增殖和ALPase活性的影响.方法:用MTT法和酶动力法分别检测MDPC-23细胞经不同浓度的FGF18刺激48 h和72 h后细胞增殖和ALPase活性的变化.结果:在一定范围内,FGF18显著促进MDPC-23细胞的增殖和ALPase活性,随着浓度的增高和时间的延长,作用更加明显.结论:FGF18可能促进小鼠成牙本质细胞的增殖和分化.
-
建立稳定表达Smad蛋白的MDPC-23细胞模型
建立稳定表达Smad蛋白的MDPC-23细胞克隆.方法:将Smad表达载体转染进MDPC-23细胞内,通过G418筛选出阳性克隆,用Flag抗体进行Western blot鉴定.结果:表达Flag融合蛋白细胞克隆为稳定整合Smad基因的阳性克隆,不表达Flag融合蛋白细胞克隆为表达空载体的细胞克隆.结论:获得稳定表达Smad的细胞克隆,为以后研究Smad在成牙本质细胞分化中的作用奠定了基础.
-
TGF-β1诱导小鼠成牙本质细胞系MDPC-23细胞凋亡
目的:研究转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是否诱导成牙本质细胞系MDPC-23细胞凋亡.方法:培养MDPC-23细胞,用不同浓度的TGF-β1刺激培养48 h后,分别用3种检测细胞凋亡的方法,包括膜联蛋白V(Annexin V)和碘化丙啶(propidium iodide,PI)双染色法、细胞凋亡的酶联免疫分析法、以及DNA琼脂糖凝胶电泳法,检测MDPC-23细胞凋亡情况.结果:TGF-β1能诱导MDPC-23细胞凋亡,且呈剂量依赖性.结论:TGF-β1在成牙本质细胞凋亡过程中发挥一定的作用.
-
RNA干涉法观察成纤维细胞生长因子18对成牙本质样细胞涎磷蛋白表达的影响
目的:通过RNA干涉的方法研究成纤维细胞生长因子18(Fibroblast Growth Factor18 ,FGF18)对成牙本质样细胞中牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)表达的影响.方法:RNA干涉质粒pH1-siFGF18瞬时转染成牙本质样细胞MDPC-23,RT-PCR检测FGF18和DSPP的表达,观察FGF18低表达对DSPP表达的影响.结果:瞬时转染RNA干涉质粒后,MDPC-23细胞内FGF18表达明显减少,与此同时DSPP的表达量也明显减少.结论:FGF18可以调控DSPP的表达,影响成牙本质细胞的分化.
关键词： 成纤维细胞生长因子18 牙本质涎磷蛋白 MDPC-23 RNA干涉 瞬时转染 -
TGF-β1对成牙本质细胞系MDPC-23中 Smads mRNA表达的影响
目的:研究TGF-β1对成牙本质细胞系MDPC-23细胞中Smads mRNA表达的影响,探讨成牙本质细胞内Smads分子基因表达调控机制.方法:培养MDPC-23细胞,细胞分为5组,分别用TGF-β1刺激0、0.5 h、1.5 h、4 h、24 h,提取总RNA.用半定量RT-PCR观察Smad 2、Smad 3和Smad 7 mRNA表达变化.结果:MDPC-23细胞表达Smad 2、Smad 3和Smad 7 mRNA.在TGF-β1作用24 h内,MDPC-23细胞内Smad 2 mRNA表达水平无明显变化.在TGF-β1作用4 h后,Smad 3 mRNA表达水平下调.Smad 7 mRNA水平在TGF-β1作用下1.5 h达到高峰,以后逐渐下降.结论:在成牙本质细胞内,TGF-β1可能通过不同的方式调控其细胞内信号分子Smad 2、Smad 3和Smad 7的表达,从而使成牙本质细胞对Smad介导的TGF-β1信号得到精确调控.
