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依达拉奉对抗化学性缺氧诱导的HEI-OC1听细胞内质网应激性凋亡
目的 探讨依达拉奉(edaravone,EDA)能否保护HEI-OC1(House Ear Institute-organ of Corti 1)听细胞对抗氯化钴(CoCl2)诱导的内质网应激性凋亡.方法 用CoCl2处理HEl-OC1听细胞,建立化学性缺氧损伤HEI-OC1听细胞的体外模型.EDA在CoCl2处理细胞前1 h加入培养基中作为预处理.细胞计数试剂盒-8(cell count kit 8,CCK-8)比色法检测细胞存活率;试剂盒法检测细胞内丙二醛(Malondialdehvde,MDA)的含量;Western blot法(蛋白印迹法)检测葡萄糖调节蛋白78(glucose regulating protein 78,GRP78;或称内质网应激蛋白)及裂解型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12(cleaved caspase-12,活化形式)的表达.结果 CoCl2在100～400 μmol/L浓度范围内处理HEI-OC1听细胞24h,可浓度依赖性地降低细胞活力;300μmol/L CoCl2处理HEI-OC1听细胞,可以上调内质网应激蛋白GRP78的表达、增加细胞内MDA的含量及活化caspase-12.在300μmoL/L CoCl2作用HEI-OC1听细胞前,用10～40μmol/L EDA预处理1 h可以浓度依赖性地抑制CoCl2诱导的毒性损伤作用,40μmol/L EDA预处理1 h可抑制CoCl2对GRP78表达的上调和对caspase-12的活化作用,以及CoCl2引起的MDA含量增加.结论 EDA可通过抗氧化及抗内质网应激引起的凋亡以保护HEI-OC1听细胞对抗CoCl2诱导的细胞损伤.
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化学性缺氧对大鼠心肌细胞葡萄糖转运蛋白4转位的影响
目的 研究化学性缺氧对大鼠心肌细胞葡萄糖转运蛋白4(Glut4)转位的影响.方法 原代培养的大鼠心室肌细胞被随机分为对照组、胰岛素组、叠氮钠(特异性细胞色素C氧化酶抑制剂)模拟的化学性缺氧组,然后利用差速离心及蔗糖密度梯度分离出细胞膜和细胞内膜,再用Western-Blot法分别测定膜组分中Glut4的表达量.结果 同对照组相比,胰岛素组、化学性缺氧组大鼠心肌细胞膜上Glut4表达量均显著增加,差别有显著性意义(P＜0.05),Western-Blot法测定平均灰度值:对照组为(26.8±2.3),胰岛素组为(61.1±3.8),化学性缺氧组为(47.2±1.5);而细胞内膜Glut4含量相应下降(P＜0.05),提示心肌细胞发生了Glut4转位.结论 胰岛素和缺氧可诱导原代培养的大鼠心肌细胞Glut4发生不同程度的转位.
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氯化钴诱导心肌细胞化学性缺氧HIF-1α表达的研究
目的:观察不同浓度的氯化钴(CoCl2)对H9C2心肌细胞的影响及其诱导化学性缺氧的佳浓度和时间.方法:用100、300、600、900、1 200 μmol/L的CoCl2处理H9C2心肌细胞,建立化学性缺氧诱导心肌细胞损伤的实验模型,分别于12、18、24、36、48 h用Hoechst 33342细胞核染色法检测心肌细胞凋亡;CCK-8试剂盒检测心肌细胞存活率;确定佳诱导浓度600 μmol/L后,分别于0、3、6、9、12、18、24、36、48 h采用蛋白印迹法检测缺氧诱导因子1α(HIF-1α)蛋白的表达；确定佳诱导时间后,用蛋白印迹法检测100、300、600、900、1 200tμmol/LCoCl,处理H9C2心肌细胞12h后HIF-1α蛋白的表达情况.结果:在600～1 200 μmol/L浓度范围内,CoCl2呈剂量依赖性地抑制H9C2心肌细胞的存活.600 μmol/L CoCl,诱导12 h后H9C2心肌细胞产生明显凋亡,诱导12～48 h范围内,12 h时H9C2心肌细胞表达的HIF-1α蛋白高；100～1 200 μmol/L CoCl2诱导H9C2心肌细胞12 h,其中600 μmol/LCoCl,诱导时H9C2心肌细胞表达的HIF-1α蛋白高.结论:CoCl2诱导H9C2心肌细胞化学性缺氧的佳浓度为600 μmol/L,此时佳时间为12 h.
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多次化学性缺氧对大鼠海马CA1区神经元凋亡及Bcl-2蛋白表达的影响
目的研究不同间隔时间多次化学性缺氧对大鼠海马CA1区神经元凋亡及Bcl-2蛋白表达的影响.方法应用原位末端标记技术及免疫组化技术,观察分析对照组(A组)、3-硝基丙酸(3-NPA)连续给药组(B组)、3-NPA间隔给药组(C组)大鼠海马CA1区神经元凋亡及Bcl-2蛋白表达情况.结果 (1)大鼠海马CA1区神经元凋亡B组较A、C组有显著增加(均P<0.05),而A组与C组比较差异无显著性(P>0.05);(2)Bcl-2蛋白免疫反应强度C组较A、B组增强非常显著(均P<0.001),而A组与B组比较差异无显著性(P>0.05).结论连续多次应用小剂量3-NPA可使大鼠海马CA1区神经元凋亡明显增加,间隔多次应用小剂量3-NPA对神经元有保护作用.
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神经生长因子对化学性缺氧神经细胞的保护作用
目的:研究NGF对化学性缺氧神经细胞的保护作用.方法:采用原代培养胚胎小鼠大脑皮层神经细胞KCN急性缺氧损伤模型,观察系列实验指标:利用MTT比色法观察NGF(100ng/ml)对缺氧神经细胞的作用;检测细胞外液LDH释放量以观察NGF对缺氧神经细胞膜稳定性的影响;光镜、透射电镜观察NGF对缺氧神经细胞形态的影响.结果:NGF能改善细胞形态,提高缺氧神经细胞的活力,降低LDH释放量.结论:NGF对化学性缺氧神经细胞有保护作用.
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银杏总内酯对化学性缺氧神经细胞的保护作用
目的:研究银杏总内酯对化学缺氧神经细胞的保护作用.方法:采用原代培养胚胎小鼠大脑皮层神经细胞氰化钾急性缺氧损伤模型,观察系列实验指标:(1)利用四甲基偶氮唑比色法观察银杏总内酯(37.5μg/ml)对缺氧神经细胞的作用;(2)检测细胞外液乳酸脱氢酶释放量以观察银杏总内酯对缺氧神经细胞膜稳定性的影响;(3)光镜、透射电镜观察银杏总内酯对缺氧神经细胞形态的影响.结果:银杏总内酯能改善细胞形态,提高缺氧神经细胞的活力,降低乳酸脱氢酶释放量.结论:银杏总内酯对化学性缺氧神经细胞有保护作用.
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坏死性凋亡介导化学性缺氧引起的HT22海马神经元损伤和炎症
目的 探讨坏死性凋亡(necroptosis)是否参与化学性缺氧诱导的小鼠HT22海马细胞损伤和炎症.方法 采用化学性缺氧模拟剂氯化钴(CoCl2)作用HT22细胞建立化学性缺氧损伤的细胞模型.蛋白质免疫印迹法测定受体相互作用蛋白3(receptor interacting protein 3,RIP3)的水平;应用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)测定海马细胞的存活率;乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒检测细胞培养液中的LDH活性;罗丹明123染色荧光显微镜照相法检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP);双氯荧光素染色荧光显微镜照相法测定胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成水平;ELISA法检测细胞培养液中白介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平.结果 600 μmol·L-1 CoCl2作用HT22细胞36 h可产生明显的细胞毒性作用,使细胞存活率降至(52.0±2.65)%,成功建立化学性缺氧损伤的海马细胞模型;此外,CoCl2可引起HT22细胞的多种损伤和炎症,表现为培养液中LDH活性升高,ROS过度生成,MMP丢失以及炎症因子(IL-1β和TNF-α)分泌均增多.40~100 μmol·L-1坏死性凋亡抑制剂necrostatin-1(Nec-1)共处理可抑制CoCl2引起的HT22细胞存活率降低,其中80 μmol·L-1时对细胞毒性的抑制作用明显.同时,80 μmol·L-1 Nec-1可对抗CoCl2可引起HT22细胞的上述多种损伤和炎症.此外,CoCl2处理HT22细胞6~48 h可促进RIP3的表达水平,Nec-1可明显抑制CoCl2对RIP3表达的上调作用.结论 坏死性凋亡介导化学性缺氧诱导的HT22海马神经元损伤和炎症.
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PI3K/Akt信号通路在硫化氢保护PC12细胞对抗化学性缺氧损伤的作用
目的 探讨硫化氢(H2S)对PC12细胞PI3K/Akt信号通路的影响及该通路在H2S神经保护中的作用.方法 Western blot 法检测H2S供体硫氢化钠(NaHS)处理PC12细胞诱导Akt磷酸化的水平;CCK-8 比色法检测细胞存活率;应用碘化丙啶(PI)染色流式细胞术检测细胞凋亡率.结果应用不同浓度NaHS处理PC12细胞30 min,在50~400 μmol·L-1浓度范围内,呈浓度依赖性地上调Akt磷酸化的水平,但随着NaHS浓度的增加,磷酸化Akt表达量逐渐下降;Ly294002明显抑制了NaHS对Akt磷酸化水平的上调作用.NaHS预处理可以保护PC12细胞对抗600 μmol·L-1 CoCl2诱导的损伤,使细胞存活率提高及细胞凋亡率降低.而在预处理前使用PI3K/Akt信号通路抑制剂Ly294002,则明显地减弱了H2S的神经细胞保护作用.结论 H2S可通过激活PI3K/Akt信号通路保护PC12细胞对抗化学性缺氧损伤.
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Survivin在PC12细胞对抗化学性缺氧损伤中的作用
目的 探讨存活素(survivin)在PC1_2细胞对抗氯化钴(CoCl_2) 诱导损伤中的作用.方法 应用不同浓度的CoCl2处理PC12细胞不同时间,建立化学性缺氧诱导PC12细胞损伤的实验模型.应用CCK-8比色法检测细胞存活率;Western-blot法检测CoCl_2诱导缺氧与survivin表达间的量效(200～1 000 μmol·L~(-1))和时效(0～48 h)关系.结果 CoCl_2可明显抑制PC12细胞的存活率,且呈浓度和时间依赖性.应用不同浓度CoCl_2处理PC12细胞24 h,在200～600 μmol·L~(-1)浓度范围内,呈浓度依赖性地促进survivin表达,600 μmol·L~(-1) CoCl_2诱导survivin表达达高峰,超过此浓度,则随着CoCl_2浓度的增加,survivin表达逐渐下降,CoCl_2浓度达1 000 μmol·L~(-1)时,survivin基本不表达;应用600μmol·L~(-1) CoCl_2处理PC12细胞,在0～36 h时间范围内,呈时间依赖性地促进PC12细胞survivin的表达,但随着处理时间的延长,survivin的表达逐渐下降;加入2 μmol·L~(-1) Hsp90抑制剂17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-AAG),不仅可以降低600μmol·L~(-1) CoCl_2诱导的survivin高表达,而且加重了600 μmol·L~(-1) CoCl_2对PC12细胞的损伤作用,使细胞存活率降低.结论 survivin表达上调可能是PC12细胞对抗化学性缺氧损伤的内在防御机制之一.
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热休克蛋白90在硫化氢保护PC12细胞对抗化学性缺氧损伤中的作用
目的 探讨热休克蛋白90(Hsp90)在硫化氢(H_2S)保护PC12细胞对抗氯化钴(CoCl_2)引起的化学性缺氧损伤中的作用.方法 在PC12细胞建立H_2S预处理对抗CoCl_2诱导PC12细胞损伤的实验模型.应用细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测细胞存活率;Hoechst 33258染色荧光显微镜照相术检测凋亡PC12细胞的形态学改变;应用碘化丙啶(PI)染色流式细胞术检测细胞凋亡率;免疫印迹法(Western blot)检测Hsp90的表达.结果 H_2S的供体400 μmol·L~(-1)硫氢化钠(NaHS)可上调PC12细胞Hsp90的表达,NaHS作用3 h,Hsp90表达达高峰,作用24 h时表达恢复到基础水平;NaHS也能明显地增加CoCl_2引起的Hsp90的表达上调.NaHS预处理能对抗CoCl_2引起的PC12细胞损伤,提高细胞存活率,降低细胞凋亡率.Hsp90抑制剂17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-AAG)可拮抗NaHS预处理对Hsp90表达的上调作用,并明显地减弱H_2S诱导的适应性细胞保护作用.结论 H_2S能保护PC12细胞对抗CoCl_2诱导的低氧损伤作用,诱导Hsp90表达上调可能是其细胞保护机制之一.
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硫化氢对抗化学性缺氧引起的心肌细胞损伤及其机制
目的 观察H2S对氯化钴 (CoCl2) 诱导的H9C2心肌细胞缺氧性损伤的影响,探讨其作用机制.方法 用CoCl2处理H9C2心肌细胞,建立化学性缺氧诱导心肌细胞损伤的实验模型.NaHS(H2S的供体)在CoCl2处理H9C2心肌细胞前30 min加入培养基中,作为预处理.应用CCK-8比色法检测细胞存活率;PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western blot法检测Cleaved Caspase-3的表达;GSSG试剂盒检测GSSG/(GSSG+GSH) 的比值;双氯荧光素 (DCFH-DA) 染色荧光显微镜照相检测细胞内的活性氧 (ROS);罗丹明123 (Rh123)染色荧光显微镜照相检测线粒体膜电位 (MMP).结果在400～800 μmol·L-1浓度范围内,CoCl2处理H9C2心肌细胞36 h,呈剂量依赖性地降低细胞存活率.在600 μmol·L-1 CoCl2处理H9C2心肌细胞前30 min,应用400 μmol·L-1 NaHS可明显地抑制CoCl2对细胞的损伤作用,使细胞存活率明显升高,细胞凋亡率及Cleaved Caspase-3表达降低;并使H9C2心肌细胞内GSSG/(GSH+GSSG) 比值及ROS水平明显降低,同时明显地改善MMP.结论 H2S能明显地对抗化学性缺氧诱导的心肌细胞损伤,此保护作用与其降低GSSG/(GSH+GSSG)比值和ROS水平,改善MMP,抑制Caspase-3活化等机制有关.
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NGF对CoCl2诱导的化学性缺氧神经元HIF-1α表达的影响
以CoCl2诱导的原代培养胚胎小鼠大脑皮层神经元为缺氧模型,Western blot分析神经生长因子(NGF)对神经元低氧诱导因子-1α(HIF-1α)及磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)表达的影响.发现正常培养的神经元HIF-1α、p-ERK表达水平较低,CoCl2缺氧处理后表达升高;单独NGF处理或预加NGF再缺氧处理时两者表达均明显上调;ERK特异性抑制剂PD98059处理后两者表达下调,NGF能阻止这种抑制作用;酪氨酸蛋白激酶的抑制剂Genistein处理能下调HIF-1α的表达,NGF不能阻止这种抑制作用;Genistein处理后p-ERK表达无变化,预加NGF则表达水平上调.认为NGF抗缺氧损伤作用可能与HIF-1α、p-ERK信号通路的激活有关.
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p38MAPK在银杏内酯和NGF预保护的化学性缺氧神经元中的表达
采用原代培养胚胎小鼠大脑皮层神经元KCN(0.5 mmol/L)和CoCl2(125 μmol/L)化学性缺氧损伤模型,Western blot分析神经元中磷酸化p38丝裂素激活蛋白激酶(p-p38MAPK)在不同处理的缺氧神经元中的表达.结果 正常培养的神经元p-p38表达水平较低,KCN或CoCl2缺氧处理后表达略升高,预加银杏内酯(Gin,37.5 μg/ml)或神经生长因子(NGF,100 ng/ml)再缺氧处理时p-p38的表达明显上调.p-p38在酪氨酸蛋白激酶的抑制剂Genistein(150 μmol/L)处理的神经元中表达的变化不明显.提示Gin和NGF抗缺氧损伤作用可能与p38信号通路的激活有关.
关键词： p38丝裂素激活蛋白激酶 银杏内酯 神经生长因子 化学性缺氧 -
硫化氢对PC12细胞存活素表达的影响及其神经保护作用
目的 探讨硫化氢(H2s)对PC12细胞存活素表达的影响及其神经保护作用.方法 应用Western blot检测不同浓度(50～800 μmol/L)的H2S供体硫氢化钠(NaHS)处理PC12细胞不同时间(0～180min)诱导PC12细胞存活素表达的量效和时效关系;细胞计数Kit-8(CCK-8)比色法检测细胞的存活率.结果应用不同浓度NaHS处理PC12细胞30 min后.在50～200 μmol/L浓度范围内呈浓度依赖性地促进存活素表达:但随着NaHS浓度的增加,存活素表达逐渐下降,当NaHS 浓度达800 μmol/L时存活素表达低于正常.应用400 μmo/L NariS处理PC12细胞不同时间,在0～60min时间范围内呈时间依赖性地促进PC12细胞存活素的表达,但随着处理时间的继续延长,存活索的表达逐渐下降.另一方面.400 μmo/L NariS预处理还能增强氯化钴(COCl2)对存活素表达的促进作用.并可显著减轻CoCl2对PC12细胞的损伤作用,使细胞存活率增加.结论 在一定浓度和时间范围内H2S可上调存活素的表达,此作用可能与其保护PC12细胞对抗化学性缺氧损伤有关.
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活性氧清除剂保护心肌细胞对抗化学性缺氧损伤
目的 探讨活性氧(ROS)清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)能否保护H9c2心肌细胞对抗化学性缺氧引起的损伤.方法 应用化学性低氧模拟物氯化钴(CoCl_2)处理H9c2心肌细胞,建立化学性缺氧损伤心肌细胞的实验模型.在CoCl_2处理H9c2心肌细胞前60min把NAC加入培养基中,作为预处理.应用CCK-8比色法检测细胞存活率;双氯荧光素(DCFH-DA)染色荧光显微镜照相检测细胞内ROS水平;罗丹明123(Rh123)染色荧光显微镜照相检测线粒体膜电位(MMP);谷胱甘肽试剂盒检测GSSG/(GSSG+GSH)的比值.结果 600 μmol/L CoCl_2明显地降低细胞存活率.在CoCl_2处理H9c2心肌细胞前60 min,应用500～2000μmol/L NAC能剂量依赖性地抑制CoCl_2对心肌细胞的损伤作用,使细胞存活率显著升高.2000/μmol/LNAC能明显地对抗CoCl_2引起的氧化应激反应,使H9c2心肌细胞内GSSG/(GSSG+GSH)的比值及ROS水平明显降低,并明显地对抗CoCl_2对MMP的抑制作用.结论 NAC能显著地对抗化学性缺氧诱导的心肌细胞损伤,此心肌细胞保护作用与其降低GSSG/(GSSG+GSH)的比值及ROS水平,改善MMP等机制有关.
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当归挥发油对化学性缺氧小鼠脑损伤的保护作用研究
目的 初步探讨当归挥发油对化学性缺氧小鼠脑损伤的保护作用.方法 将40只昆明种小鼠随机分为4组(空白组、模型组及当归挥发油高、低剂量组),灌胃给药7d后,于后1次给药2h后腹腔注射亚硝酸钠800 mg/kg,记录各组小鼠的存活时间,检测脑组织中Na+ -K+ -ATPase,Ca2 -Mg2 -ATPase活性和乳酸(LD)含量,并测定脑组织中兴奋性氨基酸(EAA)谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Gly)、γ-氨基丁酸(GA-BA)及甘氨酸(Asp)的含量.结果 当归挥发油可显著延长化学性缺氧小鼠的存活时间,增强Na+ -K+ -AT-Pase及Ca2+ -Mg2 -ATPase活性,降低LD,Glu,GABA以及Gly含量,且作用呈剂量依赖性,对Asp无明显影响.结论 当归挥发油能明显降低缺氧小鼠脑组织中EAA含量,并改善能量代谢,从而发挥对化学性缺氧脑损伤的保护作用.
