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中耳胆脂瘤上皮中CYLD、c-jun、Ki-67的表达及意义
目的：研究抑癌基因CYLD (cylindromatosis)、原癌基因c-jun及细胞核增殖相关抗原Ki-67在中耳胆脂瘤上皮细胞中的表达情况，分析它们之间的相互关系，探讨CYLD、c-jun、Ki-67在中耳胆脂瘤发病机制中的可能作用。方法采用免疫组化技术检测CYLD、c-jun及Ki-67蛋白产物在30例中耳胆脂瘤上皮组织（实验组）及20例正常耳后皮肤上皮组织（对照组）中的表达情况。结果 CYLD蛋白产物阳性表达定位于细胞浆，其在中耳胆脂瘤上皮中主要见基底层弱阳性或阳性表达，而在对照组正常耳后皮肤上皮全层均见阳性表达或强阳性表达, CYLD蛋白在中耳胆脂瘤上皮中的表达明显低于正常耳后皮肤（X2=16.333, p=0.000, p<0.05）。c-jun蛋白产物阳性表达定位于细胞浆和细胞核，其在中耳胆脂瘤上皮中上皮全层均见阳性表达或强阳性表达，而在对照组正常耳后皮肤上皮中均仅见基底层弱阳性或阳性表达，c-jun蛋白在中耳胆脂瘤上皮中的表达明显高于正常耳后皮肤（X2=14.901, p=0.000, p<0.05）。Ki-67蛋白产物定位于细胞核，细胞质内未见Ki-67蛋白表达。其在中耳胆脂瘤上皮基底层、棘层，甚至颗粒层中均可见阳性或强阳性表达，而在对照组正常耳后皮肤上皮中均仅见基底层弱阳性或阳性表达，Ki-67蛋白在中耳胆脂瘤上皮中的表达明显高于正常耳后皮肤（X2=13.675,P=0.000,P<0.05）。Spearman相关性分析发现中耳胆脂瘤上皮细胞CYLD、c-jun蛋白表达存在负相关（rs=-0.381, P=0.038,P<0.05）。结论与正常耳后皮肤的上皮细胞相比，中耳胆脂瘤上皮细胞具有高度增殖的能力。CYLD、c-jun异常表达可能与中耳胆脂瘤发生、发展密切相关。在中耳胆脂瘤上皮中可能也存在CYLD对c-jun表达的负调节。
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microRNA-130b促进三阴性乳腺癌细胞及其作用机制
目的：探讨microRNA-130b（miR-130b）的表达差异对三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC) MDA-MB-231细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响及机制。方法：通过LipofectamineTM 2000将miR-130b抑制剂或模拟物及阴性对照转染到MDA-MB-231细胞中。应用实时定量聚合酶链反应(quantitative real time-polymerase chain re-action，qRT-PCR)检测miR-130b表达和转染效率。应用MTT实验、克隆形成实验、划痕实验以及transwell实验，检测miR-130b模拟物或抑制剂对MDA-MB-231细胞功能影响。应用生物信息学网站寻找miR-130b可能的靶基因。应用双荧光素酶载体实验验证预测的靶基因，并通过qRT-PCR以及Western印迹实验进一步证实。结果：MDA-MB-231细胞转染miR-130b抑制剂或模拟物。与阴性对照组相比，模拟物组miR-130b的表达显著升高，抑制剂组miR-130b的表达显著下降，差异有统计学意义（P<0.01）。与阴性对照组相比，模拟物组细胞增殖（P<0.05）、克隆形成（P<0.05）、侵袭（P<0.01）及迁移（划痕试验P<0.05，transwell试验P<0.05）能力明显增高。相反，抑制剂组细胞增殖（P<0.05）、克隆形成（P<0.05）、侵袭及迁移（划痕试验P<0.05，transwell试验P<0.01）能力较阴性对照组明显受抑制。生物信息学技术预测 CYLD 为 miR-130b 的潜在靶基因。双荧光素酶载体实验结果显示转染 miR-130b 模拟物＋psciCHECK2-CYLD 3′UTR（野生型）后荧光素酶活性较转染阴性对照＋psciCHECK2-CYLD 3′UTR（野生型）降低57.21%（P<0.001）。此外，与阴性对照组相比，CYLD基因mRNA水平在抑制剂组或模拟物组均无明显改变(P>0.05）；但CYLD蛋白表达在抑制剂组明显上调，模拟物组的表达明显下降（P<0.001）。结论：miR-130b可促进TNBC MDA-MB-231细胞的增殖、侵袭及迁移，其作用至少部分通过抑制CYLD基因实现。
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CYLD信号通路与肿瘤
圆柱瘤基因CYLD编码的蛋白是一种去泛素酶,在人体内广泛分布,可去泛素化TRAFs、NEMO、Bcl-3及p53等信号分子,调控细胞NF-κB和JNK等信号途径,在细胞周期的调控、介导细胞凋亡、抑制肿瘤发生等分子事件中有着重要的调控作用.CYLD基因缺陷或缺失主要导致头部或面部的皮肤肿瘤,如多发性家族性毛发上皮瘤(MFF),家族性圆柱瘤(FC)和Brooke-Spiegler综合症(BSS),此外,CYLD在宫颈癌、肾癌、结肠癌、肝癌形成的信号途径中也均表现为下游调控.
关键词： CYLD 圆柱瘤 NF-κB c-Jun氨基末端激酶 Bcl-3 -
CYLD基因与皮肤附属器肿瘤的研究进展
圆柱瘤、毛发上皮瘤、Brooke-Spiegler综合征均是临床少见的呈常染色体显性遗传的皮肤附属器肿瘤，其发生与CYLD基因突变密切相关。CYLD是一种肿瘤抑制基因，编码去泛索化蛋白酶，通过去泛素化核因子κB抑制蛋白激酶复合体的调节亚基、肿瘤坏死因子受体相关因子等信号分子负性调节核因子-κB途径，从而抑制肿瘤的发生。概述CYLD基因与皮肤附属器肿瘤的发生、基因型与表型的关系、皮肤肿瘤的治疗新进展。
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雷公藤红素促进RIP1蛋白的去泛素化增强TNF-α对结肠癌细胞的凋亡诱导活性的研究
目的 探讨中药活性成分雷公藤红素对TNF-α体外抗结肠癌活性的影响并研究其机制.方法 用雷公藤红素联合TNF-α体外治疗结肠癌细胞系SW480,MTT法检测SW480细胞的细胞活力.SW480细胞用雷公藤红素联合TNF-α治疗后,Annexin V/PI染色法检测细胞的凋亡,Western blot法检测细胞caspase-8、caspase-9和caspase-3的活化和对CYLD蛋白表达的影响,并用免疫共沉淀法检测SW480细胞RIP1蛋白的泛素化水平.结果 雷公藤红素联合TNF-α对结肠癌细胞系SW480的细胞活力抑制率和凋亡诱导活性均显著高于雷公藤红素及TNF-α单治疗组.雷公藤红素联合TNF-α对SW480细胞caspase-8、caspase-9和caspase-3的活化显著高于雷公藤红素及TNF-α单治疗组,且两者联合治疗后,caspase-8的活化时间显著早于caspase-9和caspase-3.SW480细胞用雷公藤红素联合TNF-α治疗后,其RIP1蛋白的泛素化水平显著低于雷公藤红素及TNF-α单治疗组.进一步研究发现,雷公藤红素能显著诱导SW480细胞CYLD蛋白的表达,而TNF-α对CYLD的表达水平无影响,当用小干扰RNA沉默CYLD的表达后,雷公藤红素对TNF-α的协同效应丧失.结论 雷公藤红素通过促进RIP1蛋白的去泛素化增强TNF-αL对结肠癌细胞的凋亡诱导活性.
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microRNA-1271靶向调控白血病细胞CYLD蛋白的表达
目的探讨人白血病细胞中微小RNA(microRNA)-1271对CYLD蛋白表达的调控作用。方法 qRT-PCR检测microRNA-1271在不同的人白血病细胞系、临床初诊未治的几种类型原代白血病细胞、正常人外周血单个核细胞中的表达差异,利用 Targetscan 信息学预测软件预测 microRNA-1271靶向CYLD基因,构建携带靶基因野生型及突变型3’非翻译区(3’UTR)(缺失了整段预测的microRNA-1271结合序列)的双荧光素酶报告基因质粒,采用脂质体 Lipo-fectamine 3000包裹双荧光素酶重组质粒及 microRNA-1271模拟物(mimic)或阴性对照,共转染HEK293A细胞,应用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定荧光素酶活性。 FAM标记的microRNA-1271抑制物和阴性对照分别核转染至人白血病细胞系K562细胞,Western blot法检测CYLD蛋白水平的表达变化。结果 microRNA-1271在不同人白血病细胞系以及临床初诊未治的原代白血病细胞中的表达均明显高于正常人外周血单个核细胞,双荧光素酶报告基因实验验证CYLD是 microRNA-1271的潜在靶基因；K562细胞中转染microRNA-1271抑制物下调 microRNA-1271后, Western blot法检测结果显示CYLD蛋白水平明显上调。结论人白血病细胞中microRNA-1271的表达上调,下调microRNA-1271后可以促进靶基因CYLD蛋白的表达, microRNA-1271有可能成为白血病治疗的新靶点。
关键词： 白血病 microRNA microRNA-1271 CYLD -
直肠癌患者肿瘤抑制因子SEMA3F、CYLD与miR-454表达水平及其相关性
目的:研究肿瘤抑制因子SEMA3F、CYLD及miR-454在直肠癌患者中的表达水平.方法:2016年1～3月,21例直肠癌患者分别检测癌灶组织、癌病灶周围组织以及直肠正常组织中的肿瘤抑制因子SEMA3F、CYLD及miR-454表达水平,分析肿瘤抑制因子SEMA3F、CYLD与miR-454的相关性,探讨三者在直肠癌发生、发展中的作用.结果:癌组织、癌旁组织以及正常组织中的SEMA3F、CYLD与miR-454表达差异均具有统计学意义(P＜0.01).转移组患者癌组织中SEMA3F、CYLD均显著低于无转移组,miR-454显著高于无转移组(P＜0.01).高分化组CRC组织中SEMA3F、CYLD表达水平显著高于中低分化组,miR-454表达显著低于中低分化组(P＜0.01).肿瘤抑制因子CYLD与miR-454具有显著负相关性(r=-0.971,P＜0.01).肿瘤抑制因子SEMA3F与miR-454具有显著负相关性(r=-0.955,P＜0.01).结论:肿瘤抑制因子SEMA3F、CYLD在直肠癌早期可见高表达,随着病情进展表达水平逐渐下降;而miR-454则起到促进直肠癌细胞异常增殖及转移的作用,随着疾病进展表达水平逐渐升高,且与SEMA3F、CYLD均呈显著负相关;肿瘤抑制因子SEMA3F、CYLD及miR-454表达对于直肠癌的诊断及病情进展、预后的评估均具有重要的参考价值.
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PDTC对急性坏死性胰腺炎大鼠急性肺损伤的影响
目的:探讨四氢化吡咯烷二硫代氨基甲酸酯( PDTC)对急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠急性肺损伤的影响.方法:36只成年SD大鼠随机均分为:假手术组,ANP组,PDTC预处理组.ANP模型采用逆行胰胆管注射5％牛磺胆酸钠的方法,PDTC预处理组在造模前lh腹腔注射PDTC( 30 mg/kg).术后6h处死动物,经支气管肺泡灌洗获取肺泡巨噬细胞(AMs),用流式细胞仪检测AMs凋亡情况,免疫组化和Western blot法测定AMs中NF-κB和CYLD活性水平；检测支气管肺泡灌洗液( BALF)中TNF- α和1L-1 β含量；同时行肺组织病理学检查和肺组织髓过氧化物酶(MPO)水平检测.结果:假手术组肺组织未见病理改变,ANP组和PDTC预处理组肺组织均出现充血、水肿、炎性渗出等病理改变,但PDTC预处理组病变程度轻与ANP组；ANP组肺组织的MPO活性,以及BALF的TNF-d,IL-1β含量较假手术组明显升高(均P＜0.05),而PDTC预处理组上述指标的升高被明显抑制,与ANP组比较,差异有统计学意义(均P＜0.05)；假手术组,ANP组,PDTC预处理组AMs凋亡率分别为(3.47±1.45)％,(1.16±0.31)％, (1.80±0.60)％,各组间差异有统计学意义(均P＜0.05)；免疫组化显示,AMs中的NF-κB在假手术组、ANP组、PDTC预处理组分别呈弱阳性、强阳性、中等阳性表达；假手术组,ANP组,PDTC预处理组AMs的NF-κB的相对表达量分别为0.08±0.03,0.18±0.06,0.13±0.04,各组间差异均有统计学意义(均P＜0.05),3组CYLD的相对表达量分别为0.32±0.09,0.15±0.05,0.26±0.08,假手术组与ANP组间差异有统计学意义(P＜0.05),但与PDTC预处理组间差异无统计学意义( P＞0.05)；ANP组,PDTC预处理组AMs中NF-κB与CYLD的表达活性均呈负相关(r=-0.708,r=-0.481,均P＜0.05).结论:PDTC可能通过抑制NF-κ B的活化从而诱导ANP大鼠肺泡巨噬细胞凋亡,并增强NF-κB负性调控因子CYLD的表达,进而减轻肺损伤.
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氯化钆预处理对ANP肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞中CYLD及NF-KB的影响
目的:观察氯化钆( GdCl3)预处理对性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠肺泡巨噬细胞(AMs)肿瘤抑制因子CYLD及NF-κB的影响,探讨CYLD在ANP肺损伤中所起的作用.方法:36只SD大鼠随机分成正常对照组,ANP组,GdCl3预处理组.采用5％牛磺胆酸钠逆行性胰胆管注射制备ANP动物模型,GdCl3预处理组在造模前30 min经尾静脉注射GdCl3( 10 mg/kg).术后6h处死各组动物,经支气管肺泡灌洗获取肺泡AMs,检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中TNF-α和IL-1 β含量,Western blot检测AMs中NF-κB及CYLD活性水平.检测肺组织髓过氧化物酶(MPO)的水平变化,并行肺组织病理学检查.结果:假手术组肺组织未见病理改变,ANP组和GdCl3预处理组肺组织均出现充血、水肿、炎性渗出等病理改变,但GdCl3预处理组病变程度轻与ANP组；ANP组肺组织的MPO活性,以及BALF的TNF-α,IL-1 β含量较正常对照组明显升高(均P＜0.05)；正常对照组,ANP组,GdCl3预处理组AMs核蛋白NF-κB的表达量分别为0.08±0.03,0.18±0.06及0.11±0.04,3组AMs的CYLD的表达量分别为0.32±0.09,0.15±0.05和0.27±0.07.ANP组,GdCl3预处理组AMs中NF-κB与CYLD的表达活性均呈负相关(r=-0.708,r=-0.571,均P＜0.05).结论:ANP肺损伤中存在CYLD低表达和NF-κB活化,GdCl3预处理能通过增加CYLD表达,减少NF-κB活化,进而减轻肺损伤.
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miR-181b通过下调CYLD蛋白影响甲状腺乳头状癌细胞的增殖和凋亡
目的 探讨miR-181b通过下调CYLD蛋白影响甲状腺乳头状癌细胞的增殖和凋亡行为及其机制.方法 qPCR检测miR-181b在甲状腺乳头状癌组织和正常甲状腺组织中的表达情况及差异;Western blotting实验检测miR-181b与CYLD蛋白之间的调控作用;克隆形成实验检测抑制miR-181b后甲状腺癌细胞增殖能力的变化情况;流式细胞术实验检测抑制miR-181b后甲状腺癌细胞凋亡行为的变化情况.结果 与正常甲状腺组织相比,甲状腺乳头状癌组织中miR-181b的表达水平相对上调,差异具有统计学意义(P<0.05);在FTC-133细胞株中miR-181b的表达水平相对较高;Western blotting实验证实miR-181b能直接调控CYLD蛋白的表达水平;抑制miR-181b的表达后可以抑制甲状腺癌细胞的增殖行为,并在一定程度上促进其凋亡.结论 miR-181b可以调控CLYD的表达影响甲状腺癌细胞的增殖和凋亡行为.
