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SET8在肾透明细胞癌中的表达及其对786-O细胞增殖迁移能力的影响
目的 探讨SET8在肾透明细胞癌组织中表达的临床意义及沉默该基因对人肾透明细胞癌786-O细胞增殖迁移能力的影响.方法 收集2006年12月至2011年12月156例肾切除术后标本,病理类型均为肾透明细胞癌.采用免疫组化染色法检测SET8蛋白在肾透明细胞癌组织中的表达,分析SET8蛋白表达与患者临床病理特征的关系.体外培养肾透明细胞癌786-O细胞,针对人SET8基因设计合成4对候选短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)序列(shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4),以脂质体Lipofectamine 2000为载体,转染肾透明细胞癌786-O细胞,荧光显微镜下观察转染效率.蛋白质印迹法检测786-O细胞中SET8蛋白的表达,筛选有效shRNA序列.将有效shRNA序列转染786-O细胞,细胞分3组:SET8-shRNA转染组(转染SET8-shRNA)、阴性对照组(转染阴性对照shRNA)、正常对照组(未转染组).对转染后的786-O细胞采用MTT法检测增殖能力;平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;划痕实验检测细胞迁移能力.结果 SET8蛋白在肾透明细胞癌组织中阳性表达率为98.7％(154/156),SET8蛋白高表达率为60.3％(94/156),SET8蛋白表达高低与肾透明细胞癌患者的肿瘤分期、肿瘤大小及淋巴结转移有关(P均＜ 0.05);在SET8-shRNA浓度为2μg/L、Lipofectamine 2000为4μl/孔的转染条件下,转染效率约70％;筛选出的佳干扰序列为SET8-shRNA2,转染48 h沉默效率可达64％.SET8-shRNA2转染组SET8蛋白表达率在转染后48 h显著低于阴性对照组、正常对照组(t=-38.174,P＜0.01;t=-58.766,P＜0.01).shRNA有效沉默SET8基因表达后,SET8-shRNA转染组786-O细胞增殖、克隆形成和迁移能力均受到显著抑制.结论 SET8蛋白在肾透明细胞癌组织中表达升高可能促进了肿瘤的发生、发展.沉默SET8蛋白表达可有效抑制肾透明细胞癌786-O细胞的肿瘤恶性生物学行为.
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Wnt通路活化对肾透明细胞癌786-o细胞体外增殖与转移潜能影响及其机制探讨
目的 Wnt信号通路参与肾癌等多种恶性肿瘤发生、发展.本研究旨在探讨Wnt通路活化对肾透明细胞癌786-o细胞体外增殖、迁移和侵袭能力的影响.方法 786-o细胞随机分为正常对照组和Wnt活化组.细胞饥饿24 h后,Wnt活化组给予20 mmol/L LiCl处理细胞12 h活化Wnt通路.反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测β-catenin、c-myc和基质金属蛋白酶7(matrix metallopeptidase-7,MMP 7)mRNA表达情况.MTT法、划痕实验、Transwell实验分别检测786-o细胞体外增殖、迁移及侵袭能力变化.结果 LiC1处理细胞12h后,β-catenin mRNA表达水平为0.935±0.037,明显高于正常对照组的0.624±0.018,t'=-22.675,P＜0.001.MTT结果显示,Wnt活化组6、12和24 h 786-o细胞增殖活性分别为1.137±0.047、1.612±0.075和1.827±0.026,正常对照组的分别为0.800±0.146、1.039±0.158和1.364±0.072,Wnt活化组细胞增殖明显增强,均P＜0.001.划痕实验可见,Wnt活化组786-o细胞划痕愈合速度为0.351±0.036,正常对照组为0.146±0.005,Wnt活化组划痕愈合速度快,t'=-17.101,P＜0.001.Transwell实验可见,Wnt活化组786-o细胞侵袭细胞数为450±17.713,正常对照组为213±9.367,Wnt活化组侵袭能力强, t'=-35.533,P＜0.001.RT-PCR结果显示,在Wnt活化组和正常对照组,c-myc mRNA表达水平分别为0.853±0.042和0.463±0.045,MMP-7 mRNA表达水平分别为0.914±0.054和0.360±0.040,Wnt活化组与正常对照组相比差异均有统计学意义,t值分别为-18.902和-24.856,均P＜0.001.结论 Wnt通路活化通过上调c-myc和MMP-7 mRNA表达促进786-o细胞增殖、迁移和侵袭.
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miR-181a在肾透明细胞癌中的表达及对肾透明细胞癌细胞786-O功能的影响
目的 探讨miR-181a在肾透明细胞癌中的表达及miR-181a对肾透明细胞癌细胞系786-O功能的影响.方法 通过qRT-PCR的方法检测miR-181a在42对肾透明细胞癌肿瘤及瘤旁组织和细胞系786-O、769-P、A498、Caki-1中的表达水平;以miR-181a mimics、miR-181a inhibitor转染786-O细胞系,通过MTS实验观察其增殖能力的改变,并通过流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡的变化.结果 miR-181a在肾透明细胞癌中的表达明显高于瘤旁组织,同时其在细胞系786-O、769-P、A498、Caki-1中的表达明显高于其在人肾小管上皮细胞HKC中的表达.在786-O细胞系中,转染miR-181a mimics可以明显促进其增殖,诱导G1/S期转换并抑制凋亡;而miR-181a inhibitor则抑制增殖,诱导G1期阻滞并促进凋亡.结论 miR-181a在肾透明细胞癌中高表达并参与肿瘤的发生和发展,提示miR-181a可能成为肾癌治疗的潜在靶点.
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肾癌细胞系SN12C和786-O无血清培养的干细胞球特性的比较
目的：本研究通过比较SN12C和786-O两株肾癌细胞系中肿瘤干细胞特征的差异性，初步探讨筛选肾癌干细胞更有效的方法。方法：以无血清培养法培养SN12C和786-O细胞，比较其在不同时间形成肿瘤干细胞球的差异；应用流式细胞术分析SN12C和786-O球体细胞中干细胞标志物的表达情况；利用裸鼠体内成瘤模型检测SN12C和786-O球体细胞成瘤能力。结果：SN12C较786-O更易形成肿瘤干细胞球且所需时间更短，即786-O在无血清培养的第7天开始形成规则的球体，而SN12C则在第5天就已形成规则的球体。SN12C和786-O球体细胞中干细胞指标表达量亦有显著性差异，在SN12C球体细胞中CD133、CD44、Nanog和Oct3/4比例明显高于786-O球体细胞，差异具有统计学意义（P<0.05）。裸鼠体内的成瘤能力实验发现SN12C明显强于786-O球体细胞。结论：SN12C肾癌细胞系通过无血清培养方法富集肿瘤干细胞球明显多于786-O，是获得肿瘤干细胞较好的研究对象。
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外源性硫化氢对人肾癌786-O细胞增殖及凋亡的影响
目的 探讨外源性硫化氢对人肾癌786-O细胞增殖和凋亡作用的影响及机制.方法 2017年6月-12月于武汉大学人民医院中心实验室进行实验,将不同浓度(0、10、25、50μmol/L)的硫化氢作用于体外培养的肾癌786-O细胞.采用MTT法检测硫化氢对细胞的增殖抑制作用;流式细胞术检测硫化氢对细胞凋亡的影响;Western blot法检测硫化氢对786-O细胞内Caspase-3和Bax蛋白表达的影响;RT-PCR法检测凋亡相关基因Caspase-3和Bax mRNA的表达水平.结果 随着硫化氢浓度的增加,786-O细胞增殖率显著降低(F=20.24,P=0.001),凋亡率增加(F=7.66,P=0.004);细胞内Caspase-3和Bax蛋白表达水平增加(F=137.64,P=0.001),凋亡相关基因Caspase-3和BaxmRNA表达均显著增强(F=28.76、63.22,P均=0.001),具有显著的剂量依赖性.结论 外源性硫化氢对人肾癌786-O细胞可显著抑制增殖和促进其凋亡,有望成为治疗和预防肾癌的有效药物.
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索拉非尼对肾癌786-O细胞株体外培养的增殖抑制作用
目的 探讨索拉非尼对体外培养的肾癌786-O细胞株细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响.方法 体外培养人肾癌786-O细胞株,给予不同浓度(10.0、5.0、2.5、1.O、0.5μmol/L)的索拉非尼混合处理,采用MTT法检测细胞增殖的变化,并采用流式细胞仪检测索拉非尼对786-O细胞凋亡和细胞周期变化的作用.结果 经索拉非尼处理后,镜下可见786-O细胞株细胞结构消失,各孔内可见大量紫黑色针状结晶物,但随着药物浓度的升高,针状结晶物逐渐减少.与对照组比较,10.0、5.0和2.5μmol/L组吸光度值均显著下降(均P<0.01)、细胞抑制率均显著升高(均P<0.01),10.0和5.0μ mol/L组细胞存活率均显著下降(均P<0.01).与对照组比较,5.0、2与、1.0μmol/L组G0/G1期细胞所占比例均显著升高(均P<0.01)、S期细胞所占比例均显著下降(均P<0.01):而G2/M期细胞所占比例仅5.0μmol/L组显著升高(P<0.01).结论 索拉非尼可以抑制人肾癌786-O细胞株的增殖,诱导肾癌细胞凋亡.
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人肾透明细胞腺癌786-O细胞株的传代培养及其生物学特性初探
目的 探讨人肾透明细胞腺癌786-O细胞株体外培养的生长特性,为进一步的实验研究积累经验.方法 将786-O细胞株于体外培养,进行传代、冻存、复苏和细胞计数等操作,并绘制细胞生长曲线.结果 786-O细胞株在体外被成功培养,生长较快,每3天传代1次.细胞生长曲线呈S形,分为潜伏期、对数生长期和停滞期,细胞倍增时间大约36 h.结论 786-O细胞株能在体外稳定地传代培养.
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桧木醇对肾癌786-O 细胞增殖及相关细胞因子的影响
目的：从体外水平研究桧木醇（hinokitio1）的抗肾癌作用，探讨其作用机制。方法采用MTT法和流式细胞术检测桧木醇对肾癌786-O细胞增殖的抑制作用和促凋亡作用的影响；采用Western-blot检测桧木醇对人肾癌786-O细胞Caspase-3剪切体、LC3和P62蛋白表达水平的影响。以3-MA验证其抗癌作用与自噬作用的关系。结果桧木醇对肾癌786-O细胞增殖有显著抑制作用，主要是通过激活Caspase 途径对细胞凋亡进行诱导。同时桧木醇可以对肾癌786-O细胞进行诱导自噬发生，使LC3蛋白的表达量出现显著上调，而P62蛋白表达则显著下调。结论桧木醇能够显著抑制肾癌786-O细胞的增殖，而且可以通过过度激活细胞自噬促进肾癌细胞凋亡。
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SiRNA联合介导Livin和Survivin基因沉默诱导人肾癌细胞786-O化疗敏感性的实验研究
目的:观察siRNA联合介导Livin和Survivin基因的沉默诱导人肾癌细胞786-O化疗敏感性的作用.方法:构建Livin和Suvivin联合靶向的小干扰RNA(siRNA)重组表达载体shRNA,然后将目的载体转染于人肾癌细胞株786-O.应用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)及Western blot方法分别检测转染前细胞经顺铂、5-FU和丝裂霉素处理后的Livin和Survivin基因的mRNA与蛋白水平的变化.应用CCK-8试验检测转染前后细胞对顺铂、5-氟尿嘧啶(5-FU)和丝裂霉素的半数致死量(IC50)、细胞增殖的变化.结果:CCK-8结果显示,联合介导Livin和Survivin基因沉默组细胞较分别单独介导细胞组化疗的敏感性明显增强(P＜0.05),且转染前后细胞对顺铂、5-FU和丝裂霉素的IC50发生显著变化(P＜0.05).结论:SiRNA联合介导Livin和Survivin基因表达下调,发挥协同增强的siRNA作用.
关键词： 肾癌 siRNA livin基因 Survivin基因 786-O细胞 -
KAI1蛋白促进786-O细胞黏附及侵袭作用的研究
目的 观察KAI1蛋白对肾透明细胞癌786-O细胞黏附及侵袭的影响,初步研究KAI1对786-O细胞黏附、侵袭作用机制.方法 逆转录PCR、蛋白免疫印迹、免疫细胞化学鉴定pCMV-KAI1细胞KAI1表达情况;细胞黏附实验及迁移实验检测细胞黏附及迁移能力;蛋白免疫印迹检测细胞黏附因子CD44及肿瘤细胞迁移抑制因子MRP-1/CD9的表达.结果 与空白对照和阴性对照组相比,pCMV-KAI1细胞中KAI1的mRNA转录水平显著升高(P ＜0.01);pCMV-KAI1细胞的黏附能力及侵袭能力都显著低于其他两组(P＜0.01);免疫细胞化学结果证实KAI1阳性染色细胞数目接近100％,且显著地高于其他两组;蛋白免疫印迹实验结果证实,pCMV-KAI1细胞中CD44的表达显著降低,而MRP-1/CD9的表达显著升高.结论 KAI1通过抑制黏附因子CD44的表达降低了细胞的黏附性,通过促发肿瘤转移抑制因子MRP-1/CD9表达的升高而降低其侵袭性.
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吉祥草提取物体外抗肿瘤活性研究
目的:以人肾癌786-O细胞作为体外抗肿瘤实验模型,筛选吉祥草的抗肿瘤活性部位.方法:采用MTT法筛选乙醇提取物及其不同溶剂萃取部分对786-O细胞体外抗肿瘤作用的活性部位；通过Hoechst 33258染色于荧光显微镜下观察细胞凋亡形态；应用流式细胞术Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡率.结果:吉祥草正丁醇萃取物对786-O细胞的抑制作用较强且呈量效和时效关系,作用48 h时IC50值为69.33 mg/L；凋亡染色显示有典型的凋亡形态出现；流式细胞仪检测吉祥草正丁醇萃取物能诱导786-O细胞凋亡并呈剂量依赖关系.结论:正丁醇部位是吉祥草抗肿瘤作用的主要活性部位,吉祥草正丁醇萃取物能抑制人肾癌786-O细胞增殖并诱导细胞凋亡.
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RNA干扰沉默SOX9对肾细胞癌786-O细胞体外增殖、凋亡及裸鼠成瘤能力的影响
目的 探讨RNA干扰沉默SOX9 (sex determining region Y-box 9)对肾细胞癌786-O细胞体外增殖、凋亡及裸鼠成瘤能力的影响. 方法 以SOX9特异性的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)序列为实验沉默组,非特异性的siRNA序列为对照组分别转染786-O细胞.采用CCK-8实验与平板克隆形成实验检测786-O细胞的增殖,采用Hoechst 33342细胞染色法检测786-O细胞凋亡.通过裸鼠成瘤实验检测RNA干扰沉默SOX9对动物体内成瘤能力的影响.采用免疫组织化学技术检测增殖抗原Ki-67蛋白的表达情况. 结果 siRNA转染细胞后,与对照组比,SOX9沉默组OD值明显降低,细胞集落数较对照组明显减少,差异具统计学意义(P＜0.05).与对照组相比,SOX9沉默组细胞凋亡明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05).动物成瘤实验结果表明,SOX9沉默组瘤体体积及重量较对照组明显减少,差异有统计学意义(P＜0.05).免疫组织化学染色表明,siRNA沉默组Ki-67阳性细胞比例较对照组明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 RNA干扰沉默SOX9能显著抑制肾细胞癌786-O细胞的增殖,促进其凋亡,并且能够抑制肾癌细胞在裸鼠体内的增殖.
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藤黄酸对人肾癌786－O细胞增殖和凋亡的影响
目的：观察藤黄酸（Gambogic acid）对人肾癌786－O细胞增殖和凋亡的影响，并初步探讨其可能的作用机制。方法：MTT法检测藤黄酸对786－O细胞的增殖抑制作用。流式细胞术检测藤黄酸对786－O细胞凋亡的影响。Western blotting检测藤黄酸对786－O细胞内凋亡相关蛋白Bcl－2、Bax及NF－κB通路相关蛋白p65、IκB表达的影响。荧光显微镜观察藤黄酸对NF－κB活性的影响。结果：藤黄酸对786－O细胞的增殖抑制率具有显著的剂量依赖性，在作用48h后其 IC50值为（3．4±0．3）μmol／L。细胞凋亡实验发现，藤黄酸能有效的诱导786－O细胞凋亡，随药物浓度增加细胞凋亡比例逐渐增大，当药物浓度达到4．0μmol／L时凋亡率为（68．1±3．6）％。Western blotting发现藤黄酸能引起Bax蛋白的上调和Bcl－2蛋白的降解，与此同时能抵抗TNF－α诱导导致的IκB降解；荧光显微成像则进一步发现藤黄酸能阻止NF－κB入核。结论：实验表明，藤黄酸能诱导786－O细胞凋亡，主要机制可能是通过其对NF－κB的信号通路的抑制实现的。
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miR-21在肾透明细胞癌中的表达及对增殖和凋亡的影响
目的 探讨miR-21在肾透明细胞癌中的表达及其临床意义,以及如何通过调节程序性细胞死亡因子4(pro-grammed cell death 4,PDCD4)的表达影响786-O肾透明细胞癌细胞系的增殖和凋亡.方法 通过分析The Cancer Genome Atlas(TCGA)肾透明细胞癌数据库,比较癌组织及正常癌旁组织中miR-21的表达水平;分析miR-21表达水平在不同临床病理分期肾癌组织中的差异;采用Kaplan-Meier法和对数秩和检验(Log-rank test)研究miR-21表达水平和患者生存之间的关系;通过转染miR-21抑制性核苷酸(AS-miR-21)下调miR-21表达水平,采用MTT和流式细胞术分别检测细胞增殖和凋亡,采用实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blot测量PDCD4 mRNA和蛋白质表达水平变化,采用双荧光素报告系统检测miR-21对PDCD4的直接调节.结果 肾透明细胞癌组织中miR-21的表达水平显著高于癌旁组织(P<0.0001).miR-21在Ⅲ期和Ⅳ期肾癌组织中表达水平显著高于Ⅰ期(P均<0.0001),miR-21表达水平与临床病理分期呈正相关(r=0.262,P<0.0001).miR-21表达水平与T分期(r=0.250,P<0.0001)与淋巴结转移阳性(N1)以及远处转移均呈正相关(P均<0.001).生存分析显示miR-21高表达患者中位生存时间显著短于miR-21低表达者中位生存时间(Log-rank,P<0.001).下调miR-21后,786-O细胞的增殖能力较对照显著降低(P<0.05),凋亡显著增加(P=0.005),PDCD4 mRNA(P=0.002)和蛋白质表达水平显著增高.双荧光素报告实验显示在转染AS-miR-21的细胞内PDCD4相对荧光强度较对照细胞显著升高(P=0.003).结论 miR-21在肾透明细胞癌组织中表达升高,与患者临床病理分期呈正相关,和患者生存呈负相关;miR-21可能通过调节PDCD4表达水平,参与调节肾透明细胞癌细胞的增殖和凋亡.
关键词： miR-21 程序性细胞死亡因子4 786-O细胞 增殖 凋亡 -
shRNA干扰肾癌细胞株786-O和OS-RC-2中HIF-2α的表达对VEGF的影响
目的 构建在哺乳动物细胞中表达的低氧诱导因子-2(HIF-2α)的短发夹RNA(shRNA)的表达质粒,在体外模拟肿瘤常氧和低氧环境下研究对血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.探讨HIF-2α、VEGF两者之间及其与肾透明细胞癌(CCRCC)的关系,HIF-2α可能为CCRCC潜在的新效靶.方法 构建HIF-2αshRNA真核表达载体质粒,shRNA测序鉴定.150 umol/L氯化钴(CoCl2)模拟细胞低氧环境.设对照组(空白、阴性)和实验组.空白对照组不做转染,阴性对照组转染空质粒,实验组转染HIF-2αshRNA重组质粒,每组均设置常氧和低氧环境组.采用Real time-PCR技术检测786-O和OS-RC-2细胞中HIF-2α基因表达情况,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western Blot检测VEGF蛋白表达情况.结果 DNA测序证实重组质粒构建成功,shRNA转染786-O和OS-RC-2细胞,实验组中HIF-2αmRNA表达明显受到抑制,且常氧较低氧环境下HIF-2αmRNA表达降低,低氧环境下凋亡显著;常氧和低氧环境下,实验组VEGF蛋白表达量均下降,且常氧环境下蛋白表达下降明显.结论 低氧环境下,HIF-2αmRNA表达量升高,促进VEGF蛋白表达.干扰HIF-2α基因后,细胞凋亡率升高,抑制VEGF蛋白表达. 该基因可能为治疗CCRCC提供了新的效靶,为下一步实验鉴定奠定基础.
