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大肠癌细胞因子基因治疗的研究现状
大肠癌的免疫基因治疗作为手术和放化疗的辅助治疗手段有重要的意义.选择编码细胞因子或其受体为目的基因导入肿瘤细胞或免疫效应细胞,在肿瘤局部产生高分泌量的细胞因子,激活抗肿瘤免疫反应,使肿瘤的生长受到抑制或坏死消退,克服了直接给药的严重毒副作用.将肿瘤特异性转录调控序列(如启动子或增强子)与细胞因子基因连接并转染细胞,驱动的目的基因,增强基因治疗的靶向性,做到有的放矢,可达到特异性治疗的目的.常见用于大肠癌基因治疗的细胞因子基因有IFN(干扰素)基因、TNF(肿瘤坏死因子)基因、IL(白介素)基因家族、CSF(集落刺激因子)基因家族、IGFR(胰岛素样生长因子受体)基因等.将多种基因联合应用,或细胞因子基因与其他治疗手段相联合可以提高抗肿瘤效应,减少毒性
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前药热化疗对转CD基因结肠癌细胞SW480的作用机制
目的:探讨5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-FC)热化疗对转染组织特异性胞嘧啶脱氨基酶(cytosine deaminase,CD)基因的大肠癌细胞SW480的作用及机制.方法:脂质体法将CEA基因顺式转录调控序列(TRS)驱动CD基因的组织特异性逆转录病毒载体G1CEACDNa转导入大肠癌细胞SW480,以G418筛选阳性克隆扩增后,采用水浴加温法,43℃作用30 min共3次,同时给予前药5-FC进行敏感试验;RT-PCR法检测目的基因的表达,MTT法检测细胞存活率,电镜检测细胞的形态学变化,流式细胞术检测细胞周期变化及凋亡.结果:SW480-CEACD细胞在43℃作用30 min共3次条件下,CD基因能稳定表达;热疗本身对SW480细胞有一定的杀伤作用(P＜0.05),转CD基因后,SW480细胞对5-FC的敏感性明显提高(P＜0.01),热疗与前药5-FC合用,对SW480-CEACD的杀伤作用显著大于对未转基因细胞的杀伤作用(P＜0.01,t=4.356,n=9),亦大于单独应用5-FC时对SW480-CEACD细胞的杀伤作用(P＜0.05,t=2.376,n=9),增加了SW480-CEACD细胞对5-FC的敏感性,电镜及流式细胞术检测显示,细胞死亡以细胞凋亡为主,前药热化疗导致结肠癌细胞SW480产生G1期阻滞,凋亡细胞比例增加.结论:热疗与前药5-FC联合应用,导致结肠癌细胞SW480产生G1期阻滞,细胞凋亡比例增加,提高了CEA组织特异性CD/5-FC系统的靶向性杀伤作用.
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CD/5-FC系统对结肠癌细胞的杀伤作用
目的:探讨组织特异性胞嘧啶脱氨基酶(cytosine deaminase,CD)/5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-FC)系统对不同分泌癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)的大肠癌细胞LoVo和SW480的靶向杀伤作用.方法:脂质体法将CEA基因顺式转录调控序列(TRS)驱动CD基因的组织特异性逆转录病毒载体GICEACDNa及非组织特异性逆转录病毒载体pCD2分别转导入大肠癌细胞LoVo和SW480,以G418筛选阳性克隆扩增后给予前药5-FC进行敏感试验.结果:LoVo-CEACD及LoVo-CD比LoVo对5-FC的敏感性明显提高(P＜0.01,t=5.688,n=9;P＜0.01,t=3.136,n=9),SW480-CEACD及SW480-CD比SW480对5-FC的敏感性明显提高(P＜0.01,t=3.437,n=9;P＜0.01,t=3.516,n=9),LoVo-CEACD比LoVo-CD对5-FC的敏感性明显增强(P＜0.05,t=2.183,n=9),而SW480-CEACD对5-FC的敏感性小于SW480-CD,SW480-CEACD对前药5-FC的敏感性低于LoVo-CEACD(P＜0.05,t=2.504,n=9),转CD基因之LoVo和SW480细胞体外实验均可观察到明显的旁观者效应.结论:组织特异性CD/5-FC系统对LoVo和SW480细胞均有明显的靶向杀伤效果,但对SW480细胞的杀伤作用小于LoVo细胞.
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PRRSV-PCV2重组病毒的构建及PRRSV转录调控机制研究
目的 本研究旨在探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性cDNA克隆作为猪圆环病毒(PCV2)的主要免疫原开放阅读框架2(ORF2)表达载体的可行性,以及利用重组病毒对PRRSV复制转录过程进行解剖.方法 以北美株PRRSV感染性克隆pAPRRS为平台进行反向遗传操作,分别在pAPRRS的ORF1和ORF2间,ORF5和ORF6间,ORF6和ORF7间插入PCV2 ORF2,且对拯救病毒vPCV进行了病毒学及分子生物学鉴定.结果 vPCV的sgmRNA2.1利用了PRRSV mRNA2的转录调控序列(TRS),形成由PRRSV GP2和PCV2衣壳蛋白组成的sgmRNA2.1.外源基因的插入同时也导致重组病毒启用新的TRS 而产生3条新亚基因组,其中sgmRNA2.2和sgmRNA2.3采用PCV2上的序列来取代PRRSV RNA2本身的TRS;另一条sgmRNA2.4则为非经典型亚基因组,其TRS在PRRSV相应的AUG下游.结论 2株PRRSV-PCV2重组病毒可以稳定传代,为进一步研发PRRSV遗传标疫苗奠定了基础;插入片段上一些类似TRS序列的引入及插入片段(718bp)过长导致PRRSV ORF2 TRS 本身和其两翼序列的RNA结构变化是引起重组病毒遗传不稳定性的主要原因;PRRSV可以利用TRS样外源序列作为转录启动子,这为进一步解剖PRRSV复制转录过程奠定了基础.
关键词： 猪繁殖与呼吸道综合征病毒 猪圆环病毒Ⅱ型 载体表达 转录调控序列 -
含人乳癌DF3/MUC1启动子转录调控序列和白喉毒素A链基因表达载体的构建
目的:构建含人乳癌DF3/MUC1启动子转录调控序列和白喉毒素A链(DTA)基因的重组表达载体.方法:利用PCR技术从人乳癌细胞MCF-7中扩增出DF3/MUC1启动子的转录调控序列并克隆入pMD18T载体中,再从pMD18T-DF3重组质粒中切下DF3/MUC1启动子的转录调控序列并亚克隆入pGL3-Basic载体,构建重组质粒pGL3-DF3.从质粒pIBI30-DTA中切下DTA片断,以DTA基因替换重组质粒pGL3-DF3中的虫荧光素酶基因,构建重组质粒pGL3-DF3-DTA.结果:构建了含人乳癌DF3/MUC1启动子转录调控序列和DTA的表达载体,酶切和测序结果与预期完全相符.结论:重组质粒pGL3-DF3-DTA构建成功.
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分泌AFP的人肝癌细胞株中阳离子脂质体介导肝癌组织特异性载体的表达
目的:研究阳离子脂质体(cationic liposome)介导甲胎蛋白(α-fetoprotein, AFP)启动子/增强子载体在分泌AFP的人肝癌细胞株中的靶向表达.方法:测定比较阳离子脂质体Lipofectin介导质粒pDR2luc、pEBAFluc转染分泌AFP的人肝癌细胞株(HepG2)、不分泌AFP的人肝癌细胞株(SMMC7721)、人肾癌细胞株(GRC)及非洲绿猴肾细胞(COS7)的转染效率,通过液体闪烁计数仪单光子计数法测定荧光素酶活性,估计转染效率.结果:①以Lipofectin介导pDR2luc转染4株细胞,荧光素酶活性在4株细胞中均能表达,且表达活性差异有统计学意义(P＜0.05);②以Lipofectin介导pEBAFluc转染4株细胞,荧光素酶活性仅在能分泌AFP的HepG2中表达.结论:含人AFP启动子/增强子的载体pEBAFluc在分泌AFP的人肝癌细胞株中可靶向表达.
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4株SARS冠状病毒基因组5′端序列的分析与比较
利用5'RACE试剂盒对从中国不同地区、不同SARS患者体中分离的SARS-CoV基因组5'端序列进行RT-PCR扩增,并将扩增产物克隆至T easy vector.扩增片段的序列测定结果表明:所分离的4株SARS-CoV基因组5'端非编码区的核苷酸序列和其他国家和地区报道的序列基本一致,而且所形成二级结构也完全相同,但与已知普通冠状病毒的差别较大.同时发现在依赖于RNA的RNA聚合酶起始密码子上游-197 nt处有冠状病毒典型的转录调控核心保守序列5'-CUAAAC-3'.
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前药热化疗对转CD基因结肠癌细胞SW480作用及其机制
有研究表明,癌胚抗原(CEA)转录调控序列可控制胞嘧啶脱氨基酶(CD)基因在CEA阳性的大肠癌组织中高效表达,在前药5-FC作用下产生选择性杀肿瘤细胞作用.研究显示,5-FC热化疗可增加其对转基因细胞的靶向性杀伤作用[1],为探讨前药热化疗作用机制,我们进行了初步研究.
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携蜂毒素基因腺病毒感染对HepG2细胞CD54表达的影响
目的研究蜂毒素基因转染对肝癌细胞生物学性状的影响.方法将蜂毒素基因置于甲胎蛋白(AFP)转录调控序列驱动下,用细菌内高效同源重组法将目的基因重组于腺病毒质粒中;将重组腺病毒质粒用Pac I酶切线性化后,脂质体介导转染293细胞进行腺病毒的包装.携有蜂毒素基因的腺病毒感染肝癌细胞后,RT-PCR实验观察蜂毒素基因是否可以被转录,流式细胞术检测CD54表达情况.结果携蜂毒素基因的重组腺病毒载体构建成功;RT-PCR实验表明蜂毒素基因可以得到转录;流式细胞术结果表明,蜂毒素基因转染可以抑制CD54分子的表达.结论蜂毒素基因转染肝癌细胞后,可改变肿瘤细胞的生物学行为,使其恶性度降低.
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肝脏特异性转录调控序列的研究进展
基因治疗是近年迅速发展的一种治疗方式,目前制约基因治疗发展的一个主要问题是其安全性和有效性难以保证,即不能达到治疗基因表达的空间、时序和表达水平的精确定位,特别是治疗基因表达的选择性不高,在非靶组织/细胞表达易产生毒副作用,并降低疗效.通过组织/细胞特异性转录调控元件使外源基因准确、有效地表达于特定组织细胞,从而提高基因治疗的有效性和安全性,已成为基因治疗领域的研究热点.目前研究表明,肝组织中的白蛋白基因和甲胎蛋白基因里有肝脏特异性转录调控序列如启动子、增强子,能启动基因仅在肝组织表达,故它们在转基因动物和基因治疗中得到广泛应用,且其联合应用对提高肝脏的特异性和转录活性有一定作用,在基因治疗研究中也得到了很好的应用,为病毒性肝炎、遗传代谢疾病、肿瘤性疾病等与肝脏密切相关疾病的致病机制和基因治疗的研究奠定了基础.本文就肝脏特异性转录调控序列的研究进展进行综述.
