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临床相关毛孢子菌生物学特性的研究
目的了解临床常见毛孢子菌的生物学特征,为临床鉴定菌种以及诊治疾病提供依据.方法对临床分离的毛孢子菌以及已知的标准菌株进行形态学以及生理学的分类鉴定;扩增rDNA基因内转录间隔区(ITS1区以及ITS2区),序列测定,鉴定菌种;测定常见抗真菌药物对毛孢子菌的低抑菌浓度,了解毛孢子菌对药物的敏感性.结果 16株菌中的6株终鉴定为阿萨希毛孢子,其余皮瘤毛孢子、皮毛孢子、真皮毛孢子各1株,头状地霉菌5株,另有2株无法鉴定到种.药物敏感性试验结果显示,大部分受试菌株,包括阿萨希毛孢子菌、头状地霉菌、皮毛孢子菌以及皮瘤毛孢子标准株对于伊曲康唑、特比萘芬及两性霉素B均不敏感.结论临床毛孢子菌株以阿萨希毛孢子为常见.形态学是区别毛孢子菌属的基础;对于临床实验室而言,rDNA ITS区序列测定是一种较好的鉴定方法.临床上治疗严重深部毛孢子菌感染患者时,好采用大剂量联合治疗方案,尤其是联合使用不同作用机制的抗真菌药物,有利于提高患者免疫力.
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毛孢子菌研究进展
近年来,随着免疫功能缺陷患者的增多,毛孢子菌已经成为临床上越来越重要的条件致病菌,医务工作者应该提高对毛孢子菌的重视和认识.本文从分类、毒力因子及致病机制、毛孢子菌感染、实验室诊断方法及抗菌药物敏感性和治疗等方面对毛孢子菌进行了系统全面的综述.阿萨希毛孢子菌是造成侵袭性感染的主要致病菌,生物膜的形成和多种酶的分泌促进毛孢子菌逃脱抗真菌药物的杀伤作用和宿主的免疫应答.基质辅助激光解析电离飞行时间质谱对毛孢子菌的鉴定具有准确、快速和低成本的优点,唑类药物是侵袭性毛孢子菌感染的一线治疗药物.
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DC-SIGN基因在阿萨希毛孢子菌小鼠皮肤感染时的表达与调控
目的 了解树突细胞C型凝集素(DC-SIGND是否参与了皮肤毛孢子菌感染过程中的免疫应答.方法 25只BALB/C小鼠备皮后皮下接种3.2×107cfu/ml的阿萨希毛孢子菌悬液,分别于接种后1、3、7、14d处死小鼠,切取皮损,RT-PCR检测皮肤毛孢子菌感染过程中DC-SIGN mRNA的表达,基因芯片技术观察免疫相关基因的改变.结果 皮下接种后3、7、14d接种侧皮肤组织标本可扩增出DC-SIGN目的片段,而未接种侧皮肤组织标本均未扩增出DC-SIGN目的片段.补体C2、前列腺素EP4受体、肿瘤坏死因子诱导蛋白cgl2-1(CGl2-1)、干扰素诱导蛋白(Ifit3)、淋巴细胞抗原6复合物、CD53抗原、CD22抗原等下调.结论 DC-SIGN参与了皮肤毛孢子菌的感染过程,它不仅抑制Th1型细胞免疫,而且可抑制前列腺素EP4受体及部分补体因子等,从而导致皮肤毛孢子菌感染的慢性化.
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IGS1、ITS和D1/D2区在毛孢子菌鉴定中的意义及国内阿萨希毛孢子菌基因分型研究
目的 比较不同DNA区域在毛孢子菌分子学鉴定方面的灵敏性和特异性以及国内临床分离5株阿萨希毛孢子菌(T. Asahii)基因型的研究.方法 用玻璃珠法提取总DNA,用D1/D2(26s)、ITS、IGS1区的特异性引物进行PCR扩增,克隆、测序;用CLUSTAL X 1.83进行比对分析,构建系统发生树并进行基因分型.结果 T. Asahii(CBS2479)、真皮毛孢子菌(T. Dermatis)、赖巴克斯毛孢子菌(T. Laibachii)3株菌D1/D2长度分别为:640、639、637 bp;ITS区长度分别为:541、528、531 bp;IGS1区长度分别为:643、515、411 bp.临床分离5株T. Asahii IGS1区长度均为643 bp.所有毛孢子菌D1/D2区序列相似性为:89%～99%,ITS区为85%～99%,IGS1区为11%～95%.临床分离菌株BZP07001,BZP07002,BZP07004,BZP07005属于基因型Ⅰ,菌株BZP07003属于基因型Ⅳ.结论 在鉴别系统发生关系较近的毛孢子菌时IGS1区序列分析优于D1/D2、ITS区,IGS1区序列分析具有更高的灵敏性和特异性.国内临床分离5株T. Asahii分属基因型Ⅰ和Ⅳ.
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阿萨希毛孢子菌感染的研究现状
阐述了阿萨希毛孢子菌的流行病学、分离现状、感染部位、临床类型以及微生物学的特征,复习有关阿萨希毛孢子菌感染的流行病学文献,发现阿萨希毛孢子菌是毛孢子菌属中重要的临床致病菌.此外对阿萨希毛孢子菌感染的治疗进行了探讨.
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干扰素γ对小鼠巨噬细胞株RAW264.7吞噬、杀伤阿萨希毛孢子菌的影响
目的 研究干扰素γ对小鼠巨噬细胞株RAW264.7吞噬、杀伤阿萨希毛孢子菌(T.asahii的作用,探讨干扰素γ临床治疗T.asahii感染的可能性.方法 不同浓度(10、100、1000 U/ml)干扰素γ与RAW264.7细胞共孵育18h后,分别与T.asahii临床株共培养45 min、4h,以不加干扰素γ组为对照组.45 min后在显微镜下观察RAW264.7细胞吞噬T.asahii的情况,计数吞噬个数及计算吞噬率.4h后检测RAW264.7细胞的杀伤活性,即检测T.asahii的菌落形成单位(cfu/ml),计算生长抑制率.采用SPSS 16.0软件进行统计学分析,作方差齐性检验后,用单因素方差分析(ANOVA)中的Bonferroni法进行各组均数间的两两比较.结果 10、100、1000 U/ml干扰素γ组小鼠巨噬细胞株RAW264.7吞噬T.asahii的个数分别为25.12±1.81、35.88±3.56、52.12±3.23,吞噬率依次为25.12％、35.88％、52.12％,与对照组吞噬T.asahii的个数(13.62±2.39)比较,差异均有统计学意义(P＜ 0.01)；RAW264.7细胞对T.asahii的杀伤活性分别为(58.62±4.89)×500、(45.50±3.02)×500、(34.62±4.24)×500 cfu/ml,生长抑制率依次为25.21％、41.95％、55.83％,RAW264.7细胞的杀伤活性与对照组(68.12±3.39)× 500 cfu/ml比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 干扰素γ呈剂量依赖性增强小鼠巨噬细胞株RAW264.7吞噬、杀伤T.asahii的作用.
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阴道定植因肯毛孢子菌的分离鉴定
目的 报道1例因肯毛孢子菌(Trichospomn inkin)的阴道定植病例并对该菌进行临床实验研究.方法 患者女,34岁,阴道分泌物增多伴异味2个月就诊.对其进行临床实验室检查,并对分离菌株进行纯化、玻片小培养鉴定、温度试验、脲酶试验、生化鉴定、体外药敏试验和分子测序基因鉴定等实验研究.结果 患者妇科体检阴道内可见乳白色均质化分泌物附着于阴道壁黏膜,阴道分泌物Nugent评分5～6分.两次阴道分泌物培养均分离出淡黄色有皱褶酵母样菌落.该菌在42℃可生长,玻片玉米琼脂小培养见菌丝顶端附着胞形成及典型八叠球菌样结构,佳生长培养基为酵母菌形态琼脂培养基,脲酶试验阳性,API 20C AUX和分子测序鉴定为因肯毛孢子菌;该菌对两性霉素B和克霉唑、氟康唑等唑类药物敏感,对氟胞嘧啶和卡泊芬净耐药.结论 国内首次发现毛孢子菌在阴道内定植,其准确鉴定有赖于表型特征、生化反应及分子测序的综合分析.
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临床分离阿萨希毛孢子菌IGS1区克隆及RFLP分析
目的 明确临床分离的5株阿萨希毛孢子菌(T.asahii)基因间隔区(IGS1)的序列,分析T.asahii种内基因多态性.方法 用玻璃珠法分别提取临床分离5株T.asahi及标准对照株总DNA,用ITS及IGS1区特异引物,PCR扩增目的区域,IGS1区扩增产物纯化后进行克隆、测序,测序结果分别提交到基因库,获取登录号.用BLAST和CLUSTAL X 1.83软件对序列进行比对分析.分别用限制性内切酶HapⅡ、MboⅠ、AluⅠ、HhaⅠ对ITS及IGS1区PCR产物进行酶切及RFLP分析.结果 6株菌均成功扩增出长度约为540 bp的ITS区及643 bp的IGS1区基因片段,IGS1区序列相似性为97%～99%.RFLP分析发现,菌株BZP07003 IGS1区HapⅡ酶切结果及菌株BZP07004 IGS1区HhaⅠ酶切结果与其他菌株不同,MboⅠ及AluⅠ酶切6株菌结果无差异,ITS区6株菌酶切结果无差异.结论 T.asabii IGS1区种内存在差异.HhaⅠ及HapⅡ可用于T.asahii种内多态性的分析研究,临床分离5株菌存在3种酶切结果,初步提示T. Asahii临床分离株可能具有种内多态性及遗传差异.
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播散性阿萨希毛孢子菌病一例
目的 报道1例阿萨希毛孢子菌血症播散性消化系统及皮肤感染,探讨诊断和治疗方法.方法 分析2年多的病史及其就诊的多家医院诊治资料.反复取多个部位溃疡坏死组织分别做组织病理检查,真菌学检查,取血、尿、粪行真菌培养,并作体外药物敏感试验,将培养菌落作rDNA ITS序列测定.作腹部B超、肝胆核磁共振及逆行胰胆管造影(ERCP)等检查.及时联合应用足量的抗真菌药物系统治疗和局部治疗.结果 病理检查发现坏死组织内大量成团孢子、少许菌丝、关节孢子及芽生孢子.坏死组织压片镜下发现大量菌丝、桶状关节孢子、芽生孢子.血液和多处溃疡组织培养均为阿萨希毛孢子菌生长.测序结果为阿萨希毛孢子菌.溃疡坏死组织及十二指肠乳头部炎性肉芽组织内均有菌丝、关节孢子.影像学检查及肝胆核磁共振及逆行胰胆管造影检查发现肝内外胆管炎、慢性胰腺炎、十二指肠乳头炎.确诊为阿萨希毛孢子菌血症--播散性毛孢子菌病.予两性霉素B和氟康唑联合治疗,后改为伊曲康唑治疗取得理想疗效.结论 在诊断复杂的疑难病例时,特别是在按结核、结节病等久治无效反而加重时,应及时考虑深部真菌病.抗真菌药物应早期足量,随病情好转后渐渐减量,直至各部位炎症痊愈时才停药.
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阿萨希毛孢子菌致小鼠播散性毛孢子菌病的实验和治疗研究
目的研究阿萨希毛孢子菌致小鼠播散性毛孢子菌病的感染条件及脏器播散情况.方法于接种阿萨希毛孢子菌前3 d及接种后第7天腹腔注射环磷酰胺进行免疫抑制;根据接种阿萨希毛孢子菌的途径将75只昆明鼠随机分为免疫抑制+静脉接种组(n=15)、免疫抑制+皮内接种组(n=7)、免疫抑制+胃肠灌注组(n=8)、免疫抑制+静脉接种+治疗组(n=15),对照组为非免疫抑制的健康小鼠,分别进行上述接种.治疗组给予脂质体两性霉素B及氟康唑治疗.对死亡小鼠的主要脏器进行组织真菌培养及病理检查.结果免疫抑制+静脉接种组12只小鼠中有10只至少有1个脏器分离出阿萨希毛孢子菌;而非免疫抑制+静脉接种组14只小鼠中有2只分离出该菌.免疫抑制+皮内接种组7只小鼠中有2只仅于接种部位出现皮损,而无其他脏器感染.其余3组非静脉接种小鼠均未出现脏器感染.治疗组小鼠的死亡只数、系统感染及受累脏器数均显著低于非治疗组(P＜0.01).感染小鼠的各脏器组织病理改变主要为急性化脓性炎症及肉芽肿性炎症,组织中可见关节孢子及菌丝.结论阿萨希毛孢子菌为一种机会致病菌,可致免疫低下或免疫缺陷宿主的皮肤或脏器感染,但对健康宿主并非绝对不致病.主要受累脏器依次为肝、肺、肾、脾、心.脂质体两性霉素B联合氟康唑可有效抑制该菌的感染和扩散.
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阿萨希丝孢酵母引起播散性毛孢子菌病国内首例报告
目的报道国内首见阿萨希丝孢酵母（ T. Asahii）所致播散性毛孢子菌病 1例。方法全面临床检查排除其他疾病；多部位皮损组织及肝穿组织活检，组织病理检查；皮损组织、口腔假膜、阴道及鼻腔分泌物、尿、粪、肝穿组织及皮损表面痂皮多次真菌培养、直接镜检证实为系统性真菌病；菌种与标准菌株对照进行培养、生化试验、菌种鉴定及 DNA序列分析；临床系统抗真菌治疗观察。结果发现皮肤、肝、肾、肠道、口腔、阴道粘膜等广泛受累，组织病理发现在感染性肉芽肿损害中有大量真菌孢子。真菌学培养均为同一菌落生长。菌落呈乳白色至淡黄色，表面褶皱，暗淡，边缘有菌丝长出。镜下见大小不一的矩形关节孢子及大量圆形或卵圆形孢子，出芽或不出芽，并见分支分隔菌丝。菌种经生化试验、糖发酵试验、同化硝酸盐试验、温度试验及碳源同化试验等终鉴定为阿萨希丝孢酵母 (No. AS 2.2174 )， DNA序列分析证实该菌与阿萨希丝孢酵母的模式菌株在核糖体 D1/D2区域碱基序列完全相同。经脂质体两性霉素 B联合氟康唑治疗 5个月后病情显著好转，各种真菌学检查阴性。结论阿萨希丝孢酵母所致播散性毛孢子菌病为国内首见；阿萨希丝孢酵母所致皮肤、粘膜、肝、脾、肾、肠道等系统损害，范围广、病程长，且基础病变不明，实为罕见。脂质体两性霉素 B联合氟康唑治疗本病疗效显著。
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Ras1、Rac1、Rho1基因在阿萨希毛孢子菌酵母相和菌丝相中的表达差异
目的 研究Ras1、Rac1和Rho1基因在阿萨希毛孢子菌酵母相和菌丝相中的表达差异,探讨其在菌丝生长过程中的作用.方法 分别培养阿萨希毛孢子菌酵母相和菌丝相,提取两组的总RNA,采用荧光定量PCR方法测定两组中Ras1、Rac1和Rho1 mRNA的相对表达量.结果 酵母相菌丝生成率(0.40％±0.53％)显著低于菌丝相(99.33％ ± 0.57％,t=13.93,P＜0.05).实时荧光定量PCR显示,以酵母相为对照组,将其Ras1、Rac1、Rho1基因表达量均设为1,则菌丝相的Ras1、Rac1、Rho1基因mRNA相对表达量分别为25.17±10.99、16.81±7.80、42.61±18.50,与酵母相比较,差异有统计学意义(t值分别为3.81、3.51、3.90,均P＜0.05).结论 Ras1、Rac1、Rho1基因可能参与了阿萨希毛孢子菌菌丝的生长过程.
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肾病综合征患儿脑脊液、血液中检出浅白隐球菌1例
患儿男，9岁。因肾病综合征反复发作，连续服用强的松每日10mg4年，近日出现发热、头痛伴恶心，体温37.7℃，经抗炎、对症治疗病情无好转。查外周血WBC 8.2×10９／L，N 0.79，L 0.21，Hb 105g／L。脑脊液压力1.95 kPa，无色微混，潘氏试验阳性，WBC 0.1×10９／L，N 0.10，L 0.90，糖1.67mmol／L，墨汁涂片找到隐球菌。血液增菌培养，第4天增菌液混浊，瓶底呈现玫瑰红色。移种血平板，35℃培养48小时，见直径0.5～1mm酵母样菌落，不溶血、外观透明、粘稠；沙氏培养基、35℃培养48小时，见直径约1mm、圆形、突起、有粘稠感、奶油样菌落。葡萄糖肉汤中沉淀生长，无菌膜；血清中不形成芽管；吐温80玉米琼脂上不形成菌丝、无关节孢子。菌体形态为革兰氏阳性圆形或椭圆形孢子体，周围绕一圈透明荚膜，孢子内有反光颗粒。该菌株触酶阳性，氧化酶阴性，迅速分解尿素、淀粉样化合物形成。硝酸钾利用阳性。糖发酵试验：葡萄糖、乳糖、麦牙糖、蔗糖均阴性。同化试验：肌醇、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、棉籽糖、阿拉伯糖均阳性，乳糖、半乳糖阴性。属间鉴别：脲酶阳性除本菌属外还有红酵母菌，毛孢子菌属。本菌能同化肌醇不产生红色素，此系与红酵母的主要区别；不产生关节孢子，则有别于毛孢子菌。属内鉴别：根据本菌氧化酶阴性、利用硝酸钾、同化阿拉伯糖等可与新型隐球菌相鉴别；而非致病性隐球菌37℃不生长、无荚膜、不产生淀粉样化合物。综合菌落、菌体形态、培养特性及生化反应结果，该菌鉴定为浅白隐球菌。
