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EGB通过降低HCY水平减轻T2DM大鼠心肌内质网应激的研究
目的 探讨银杏叶提取物(EGB)能否通过降低2型糖尿病(T2DM)大鼠血浆同型半胱氨酸(HCY)水平减轻心肌内质网应激(ER),减轻心肌损害.方法 健康SD大鼠30只随机分为3组:空白组(NC)组、糖尿病组(DM)组、DM+银杏叶注射液(EGB)组；每组10只.在第9周处死大鼠,双抗体夹心法检测血浆HCY水平,心肌masson染色观察心肌胶原纤维增生,western检测心肌糖调节蛋白(GRP78)表达水平.结果 (1)EGB组大鼠血浆同型半胱氨酸水平高于NC组(P＜0.05),但低于DM组(P＜0.01)；(2)EGB组胶原容积分数(CVF)高于NC组(P＜0.01)低于DM组(P＜0.05);(3) EGB组心肌GRP78表达水高于NC组(P＜0.05),但低于DM组(P＜0.05).结论 (1)EGB可以降低2型糖尿病( T2DM)大鼠血浆同型半胱氨酸(HCY)水平；(2)通过降低血浆HCY水平降低心肌GRP78表达水平能减轻心肌内质网应激,减轻心肌损害.
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利用RNA干扰技术抑制糖调节蛋白78在大肠癌细胞系中的表达
目的:观察靶向shRNA质粒表达载体(PGPU6/GFP/Neo-GRP78)对大肠癌PKO细胞系GRP78mRNA汲蛋白的作用.方法:采用免疫组织化学及半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测结直肠腺癌、腺瘤及正常黏膜组织,PGRP7865表达:使用脂质体2000将GRP78靶向shRNA质粒表达载体(PGPU6/GFP/Neo-GRP78)转染至RKO细胞内,应用RT-PCR与Western blot法检测GRP78基因及蛋白的表达.结果:GRP78在结直肠癌组织中的表达水平显著高于正常黏膜组织(9.470±0.754 vs 0.780±2.468,Z=-8.140,P<0.05),腺瘤组织中其表达水平高于正常黏膜组织而低于癌组织,差别有统计学意义(5.330±2.744 vs 1.000±0.840,9.560±2.093,均P<0.05).然而在mRAN水平上,GRP78在3种组织中的表达无统计学意义:靶向shRNA质粒表达载体PGPU6/GFP/NeoGRP78能明显抑制RKO细胞中GRP78蛋白及mRNA的表达(F=11.670,27 1.860,均P<0.05).结论:靶向shRNA质粒表达栽体(PGPU6/GFP/Neo-GRP78)能明显抑制RKO细胞GRP78mRNA及蛋白的表达,为进一步明确GRP78在结直肠腺癌细胞增殖动力学中的作用奠定了实验基础.
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平阳霉素诱导人脐静脉血管内皮细胞HUVEC凋亡的作用机制
目的 检测不同浓度平阳霉素(pingyangmycin,PYM)作用24h对人脐静脉血管内皮细胞HUVEC细胞的生长抑制及凋亡的影响,探讨平阳霉素诱导HUVEC细胞凋亡佳浓度及有关作用机制.方法 用不同浓度的平阳霉素作用HUVEC细胞24h,以细胞增殖-毒性8检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测比较0.1、10、100、1000μg/ml平阳霉素作用24h后对HUVEC细胞的抑制作用,用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶细胞凋亡检测试剂盒(Annexin-V FITC/PI apoptosis kit)检测不同浓度PYM对HUVEC细胞凋亡作用的影响,蛋白印迹法(Western blot)检测不同浓度平阳霉素作用HUVEC细胞后内质网应激蛋白GRP78和CHOP的表达.结果 CCK-8结果显示随平阳霉素浓度的升高,对HUVEC细胞的抑制作用越明显(P＜0.05);然平阳霉素药物浓度100μg/ml和1000μg/ml组相比,差异无显著性统计学意义(P＞0.05).流式细胞检测显示0.1、1、10、100μg/ml平阳霉素作用24h后细胞凋亡率分别为5.37％±1.63％、12.70％±1.57％、24.70％±6.99％、23.60％±0.80％,坏死率分别为4.87％±2.09％、7.32％±3.88％、39.10％±6.18％、66.30％±0.40％,随药物浓度增加而增高,过高浓度细胞坏死占主导,和对照组相比,差异具有统计学意义(P＜0.05);Western blot法结果显示,平阳霉素各浓度作用24h后促进内质网应激蛋白GRP78和CHOP的表达.结论 平阳霉素在体外能明显抑制HUVEC细胞生长并促进其凋亡,当平阳霉素浓度达到100μg/ml时,细胞以坏死为主;平阳霉素可能通过内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)途径诱导HUVEC细胞凋亡.
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重复高压氧预处理对大鼠脊髓缺血再灌注损伤时糖调节蛋白 78 表达的影响
目的 探讨重复高压氧预处理对大鼠脊髓缺血再灌注损伤保护中糖调节蛋白78(GRP78)表达的影响.方法 雄性SD大鼠36只,体重250～300g,采用随机数字表法,将其随机分为3组(n=12)假手术组(S组)、脊髓缺血再灌注组(I/R组)和重复高压氧预处理(HOP组).HOP组采用高压氧预处理[1000ml/L O2,2.5 atmosphere absolute( ATA),1h/d,5天],后一次处理后24h,I/R组和HOP组采用Zivin法制备脊髓缺血再灌注模型(缺血15min,再灌注1h),24、48、72h后分别评价后肢运动功能,然后处死大鼠,取L5～7节段脊髓组织,测定GRP78的mRNA及其蛋白表达水平,光镜下观察病理学结果.结果 与S组比较,I/R组和HOP组后肢运动功能和脊髓前角正常运动神经元计数降低,脊髓组织GRP78 mRNA及蛋白表达水平上调(P＜0.05)；与I/R组比较,HOP组后肢运动功能和脊髓前角正常运动神经元计数升高,脊髓组织GRP78 mRNA及蛋白表达水平上调(P＜0.05).HOP组脊髓组织病理学损伤程度轻于I/R组.结论 重复高压氧预处理可上调大鼠脊髓缺血再灌注时GRP78表达,从而减轻大鼠脊髓缺血再灌注损伤.
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降糖舒心方对糖尿病心肌内质网应激c-JNK凋亡旁路的影响
目的:探讨降糖舒心方(JTSX)抑制SD糖尿病大鼠心肌细胞内质网应激c-JNK凋亡旁路,减轻糖尿痛心肌重构的分子机制.方法:采用高脂饲养+链脲佐菌素制备2型糖尿病大鼠模型,成模后随机分为模型组、西药组、JTSX低剂量组(JTSX1组)和JTSX高剂量组(JTSX2组),另设正常组作对照.相应药物干预8周后,检测空腹血糖(FBG)、血脂、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)变化.用透射电镜观察心肌组织超微结构;TUNEL法检测心肌细胞凋亡水平;用RT-PCR和免疫组化分别检测c-JUN氨酸端激酶(c-JNK)和糖调节蛋白78(GRP78)的mRNA转录及其功能蛋白的表达水平.结果:与模型组相比,各给药组均能明显降低FBG(P＜0.05),升高SOD、GSH-Px(P ＜0.05);均可降低TG、LDL-C(P＜0.05),升高HDL-C(P ＜0.05);均可下调c-JNK、GRP78mRNA转录及其蛋白表达(P＜0.05),降低心肌细胞凋亡指数(AI)(P＜0.05),并改善心肌组织超微结构;与西药组相比,JTSX2疗效更显著(P＜0.05).结论:JTSX能改善糖尿病代谢紊乱,提高抗氧化应激能力,抑制内质网应激细胞凋亡通路,从而改善心肌重构,疗效具有剂量依赖性.
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SP600125对高血压全脑缺血大鼠海马区GPR78和CHOP表达的影响
目的 探讨SP600125对高血压全脑缺血大鼠海马区糖调节蛋白78(GPR78)和CAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)表达的影响.方法 分别取血压正常的雄性Wistar-Kyoto(WKY)大鼠和雄性自发性高血压大鼠,应用改良的Pulsineli 4血管阻断(4-VO)法制作全脑缺血再灌注模型；JNK特异性抑制剂SP600125干预组在高血压鼠造模前30min侧脑室注射SP600125(1Oμl).应用苏木-伊红染色观察海马区神经细胞形态变化；免疫组织化学法和免疫印迹法检测海马区GPR78和CHOP阳性细胞数量及表达变化.结果 与血压正常脑缺血组比较,高血压脑缺血组存活神经元密度降低、6h GPR78阳性细胞数量及表达水平增高,24和48h持续减少;6、24h CHOP阳性细胞数量及表达水平增高,48h减少；与高血压脑缺血组比较,SP600125干预组中各时间点存活神经元密度增加,GPR78阳性细胞数量及表达水平增高；CHOP阳性细胞数量及表达水平减少.结论 SP600125可以调控大鼠高血压全脑缺血后海马区GPR78和CHOP表达水平,减少神经细胞丢失,对神经有保护作用.
关键词： 高血压 脑缺血再灌注 内质网 糖调节蛋白78 CAAT/增强子结合蛋白同源蛋白 -
高血压大鼠全脑缺血再灌注后海马区c-Jun氨基末端激酶激活与GRP78表达的关系
目的 全脑缺血再灌注(cerebral ischemia/reperfusion,CI/R)后c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminal kinase,JNK)活化与内质网应激的内在关系尚不明确.文中探讨高血压大鼠CI/R后海马区JNK激活与糖调节蛋白78(glucose-regulated proteins 78,GRP78)表达的关系. 方法 90只雄性自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)分为假手术组、CI/R组、JNK特异性抑制剂SP600125干预组(以下简称SP600125干预组).改良的Pulsineli 4血管阻断(4-VO)法制作CI/R.分别在术后6、24、48 h取脑组织,应用甲苯胺蓝染色观察海马区神经细胞形态变化;免疫组化法和免疫印迹法检测海马区GRP78和磷酸化JNK表达. 结果 与假手术组比较,CI/R组各时间点存活神经元密度降低,GRP78表达和磷酸化JNK表达增高.与CI/R组比较,SP600125干预组中各时间点存活神经元密度增加,GRP78表达增高,磷酸化JNK表达减少,相关性分析显示CI/R组中GRP78和磷酸化JNK蛋白表达相关(r=-0.862,P＜0.01);SP600125干预组中GRP78和磷酸化JNK蛋白表达相关(r=-0.898,P＜0.01). 结论 高血压大鼠CI/R后海马区JNK激活与GRP78表达有关;抑制JNK信号通路可上调高血压全脑缺血大鼠海马区GRP78表达,对神经有保护作用.
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未折叠蛋白反应与肿瘤研究进展
癌细胞快速增殖引起恶性肿瘤进展,这需要蛋白质合成增加.内质网(endoplasmic reticulum,ER)是合成蛋白质的场所,在癌细胞中,ER功能增强,促进了蛋白质的折叠、组装和膜蛋白及其分泌蛋白的转运,上述功能与ER伴侣蛋白密切相关.干扰ER稳态在肿瘤发生具有重要作用,调节ER伴侣蛋白和未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)对恶性肿瘤具有潜在的治疗作用.
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As2O3联合衣霉素体外干预对人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响及作用机制
目的 观察三氧化二砷(As2O3)联合衣霉素(TM)体外干预对三阴性人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响,探讨其作用机制.方法 常规培养MDA-MB-231细胞并随机分为五组.空白对照组不作处理,对照组采用DMEM培养基培养,As2O3组、TM组分别用不同浓度(0.1、0.5、1、10、20、40、60、80 μmol/L)As2O3、(0.1、0.5、1、10、20、40、60、80 μmol/L)TM单独作用24 h,根据MTT法检测细胞增殖抑制率,选择0.5 μmol/L的TM为固定浓度,并联合不同浓度As2O3作用细胞24 h(联合组).用Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率,流式细胞术检测细胞线粒体膜电位,用内质网应激抑制剂4-PBA预处理细胞后用Western blotting技术检测GRP78、Caspase4蛋白表达.结果 As2O3组、TM组、联合组细胞增殖抑制率随As2O3浓度增加而升高;联合组细胞增殖抑制率与其他两组同浓度比较,P均<0.05.联合组细胞凋亡率与As2O3组比较,P<0.05.联合组线粒体膜电位与对照组比较,P<0.05.0.5 μmol/L TM在 4-PBA预处理后GRP78、Caspase4蛋白表达与预处理前比较,P<0.05.1 μmol/L As2O3+0.5 μmol/L TM在4-PBA预处理后GRP78、Caspase4蛋白表达与预处理前比较,P>0.05.结论 As2O3联合TM可协同诱导三阴性人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡,其机制可能为TM将低浓度As2O3的促细胞增殖效应逆转为抑细胞增殖效应.
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热休克蛋白27和糖调节蛋白78分布异常对心脏移植后血管病变的影响
目的 观察移植后心脏组织中热休克蛋白27(HSP27)和糖调节蛋白78(GRP78)的组织分布,探讨移植后心脏血管病变(CAV)的发病机制.方法 建立大鼠同基因(n=8)和异基因(n=8)心脏移植的Ono模型,采用免疫组织化学法[链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法]验证移植后心脏组织中HSP27和GRP78的组织分布.结果 同基因植组,HSP27和GRP78在心脏组织内均匀分布；异基因移植组,HSP27和GRP78在环血管周围心肌组织中高表达(2.24±0.36比1.04±0.10,P＜0.01；1.51±0.12比0.85±0.30,P＜0.05),而在增生的冠状动脉组织内几乎不表达(2.24±0.36比0.25±0.08,P＜0.01；1.51±0.12比0.16±0.10,P＜0.01).结论 HSP27和GRP78在异基因移植后心脏组织中分布不均,导致冠状动脉组织无力对抗免疫损伤,诱发血管平滑肌细胞过度增殖可能是CAV发生、发展的重要原因.
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前列腺素E1对高氧诱导新生大鼠脑损伤的保护作用
目的 探讨前列腺素E1(PGE-1)对高氧诱导新生大鼠脑损伤的保护作用,并观察糖调节蛋白78(GRP78)、CHOP蛋白表达的变化,为临床应用PGE-1治疗高氧引起的新生儿脑损伤提供理论依据.方法 将60只新生Wistar大鼠随机分成空气对照组、高氧脑损伤模型组和高氧脑损伤+PGE-1组.除空气对照组外均制备高氧脑损伤模型,从造模第1天起,高氧脑损伤+PGE-1组腹腔注射PGE-1,剂量为每日2μg/kg,连续7 d,其他两组以生理盐水替代.检测各组大鼠脑组织含水量,苏木精-伊红染色观察脑组织病理变化,核染色结合TUNEL染色观察脑细胞凋亡情况,Western blot法检测脑组织GRP78、CHOP蛋白水平.结果 高氧脑损伤模型组脑组织含水量高于高氧脑损伤+PGE-1组及空气对照组(P<0.05);高氧脑损伤+PGE-1组脑组织含水量高于空气对照组(P<0.05).脑组织病理切片结果显示:高氧脑损伤模型组大鼠脑实质可见炎症细胞浸润增多,轻度脑血管水肿;高氧脑损伤+PGE-1组大鼠脑实质周围炎症及水肿较高氧脑损伤模型组减轻.高氧脑损伤模型组脑组织细胞凋亡指数高于高氧脑损伤+PGE-1组及空气对照组(P<0.05);高氧脑损伤+PGE-1组脑组织细胞凋亡指数高于空气对照组(P<0.05).高氧脑损伤模型组脑组织GRP78、CHOP蛋白的相对表达高于高氧脑损伤+PGE-1组和空气对照组(P<0.05);高氧脑损伤+PGE-1组GRP78、CHOP蛋白的相对表达高于空气对照组(P<0.05).结论 PGE-1对高氧诱导脑损伤新生大鼠具有保护作用,其机制可能为通过下调GRP78、CHOP蛋白表达,从而抑制细胞凋亡.
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糖调节蛋白78在前列腺癌中的表达及对前列腺癌细胞增殖和凋亡的调控
目的 检测糖调节蛋白78(GRP78)在上结肠癌组织中的表达,探讨GRP78与结肠癌发生、发展的关系.方法 利用免疫组织化学法检测150例前列腺癌组织及相应正常前列腺组织、80例前列腺增生组织中GRP78的表达情况;设计、合成GRP78特异性微小RNA片段ShGRP78,利用DNA重组技术将其分别克隆入真核表达载体,经脂质体转染前列腺癌细胞系PC-3,G418筛选阳性克隆,半定量RT-PCR检测GRP78mRNA表达,Western blot检测GRP78蛋白表达,SRB法检测细胞存活率.结果 GRP78在正常组织中阳性率为21.3％,在前列腺增生组织中阳性率为85％,在恶性前列腺癌组织中阳性率为100％,3组之间差异有统计学意义(P＜0.01).建立两组稳定转染细胞系:PC-3-shGRP78、PC-3-shNTC,PC-3-shGRP78细胞中GRP78mRNA和蛋白表达显著下调.结论 GRP78在前列腺正常组织、前列腺增生组织及前列腺癌组织中的表达水平依次升高;GRP78 shRNA能显著抑制前列腺癌细胞增殖,诱导细胞凋亡.
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内质网应激与氧化应激在百草枯致大鼠肺纤维化中的作用
目的 探讨百草枯(PQ)中毒大鼠肺纤维化与内质网应激(ERS)的关系.方法 40只sprague-dawley(SD)大鼠按随机数字表法分为对照组(8只)和染毒组(32只),20％PQ溶液灌胃后分别于1、7、14、21 d处死大鼠取肺组织,每个时间点处死8只.苏木素-伊红(HE)染色和Masson染色观察肺组织病理变化;比色法检测肺组织丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)变化;免疫组织化学法检测肺组织中糖调节蛋白78(GRP78)表达情况.结果 HE和Masson染色结果证实成功复制肺纤维化模型;模型组大鼠肺泡炎和肺纤维化程度较对照组严重.染毒后ld肺组织MDA及GRP78蛋白表达均较对照组明显升高[MDA:(1.51±0.12) nmol/mg vs.(0.81±0.04) nmol/mg;GRP78:(14.25±6.36)vs.(3.18±1.02);P＜0.05,P＜0.01],GRP78蛋白表达于染毒后7d逐渐下降.而染毒组肺组织SOD活性在各时间点均较对照组降低(P＜0.05).结论 PQ中毒大鼠肺ERS标志性蛋白GRP78明显升高,表明ERS在PQ中毒后肺纤维中发挥一定的作用.
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非小细胞肺癌体外化疗药物敏感性与GRP78表达的相关性
背景和目的 糖调节蛋白78(GRP78)在乳腺癌细胞中表达增高并与其对化疗药物的耐药性有关,而非小细胞肺癌(NSCLC)中GRP78的表达与其对化疗药物的耐药性是否相关,研究较少.本研究拟探讨NSCLC对8种化疗药物的体外敏感性与GRP78表达的相关性.方法 采用四噻唑蓝(MTT)法对52例手术切除的新鲜NSCLC组织进行8种化疗药物体外敏感性检测;采用免疫组织化学方法检测其GRP78的表达水平.采用Spearman相关分析对NSCLC的耐药性与GRP78表达的相关性进行分析.结果 52例NSCLC对紫杉醇(PTX)、阿霉素(ADM)、卡铂(CBP)、拓扑替康(TPT)、长春瑞滨(NVB)、长春新碱(VCR)、顺铂(DDP)和鬼臼乙叉苷(VP-16)8种化疗药物的耐药率分别为42.31%、57.69%、63.46%、65.38%、67.31%、73.08%、78.85%、90.38%,其中14例表现为完全耐药.GRP78的表达水平随着肺癌恶性程度的提高而增加,且其高表达与肺癌细胞对VP-16、ADM、VCR和TPT的耐药具有相关性(P＜0.05).结论 MTT法体外化疗药物敏感性实验对NSCLC的治疗具有一定的指导作用,GRP78对判定NSCLC的恶性程度及其耐药性具有一定的参考意义.
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低氧诱导因子在肝肺综合征大鼠肺组织中的表达及其与糖调节蛋白78的关系
目的：探讨低氧诱导因子‐1α（HIF‐1α）在大鼠肝肺综合征（HPS）发病中的作用及其与糖调节蛋白78（GRP78）的关系。方法复合致病因素法制备 HPS大鼠模型。Western blotting 法检测肺组织 HIF‐1α、血管内皮生长因子164（VEGF164）及GRP78蛋白表达水平。免疫组化染色法观察肺组织VEGF受体2（VEGFR‐2）及CD105的表达。结果模型组动物肺组织HIF‐1α蛋白表达水平在第8周显著高于同期正常对照组及4周、6周组；GRP78蛋白表达随病程进展逐渐升高，至第8周达到高水平，各时间点之间以及与同期正常对照组比较差异均具有统计学意义；VEGF164蛋白表达随病程进展逐渐增加，至6周达到高峰，各时间点均显著高于同期正常对照组，6周和8周表达水平显著高于4周；VEGFR‐2及CD105免疫组化染色强度和数量均随 HPS进展逐渐增高；GRP78分别与VEGF164、VEGFR‐2及CD105的表达水平呈正相关（P＜0．05），HIF‐1α与GRP78亦呈正相关关系（P＜0．05）。结论 HIF‐1α可能在 HPS发病中起一定作用，与GRP78共同促进了肺微血管重构。
