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非浓缩尿蛋白电泳检测原发性高血压早期肾损害的临床应用
目的:探讨尿液微量蛋白与高血病早期肾损害之间的关系.方法:采用尿液电泳法分析原发性高血压病患者和正常对照尿液微量蛋白水平.结果:高血病早期患者即有明显的大分子尿蛋白升高.结论:尿液微量蛋白的检测有利于早期高血压病患者的肾损害的早期诊断及治疗.
关键词： 高血压/并发症 尿分析 蛋白质类/分析 肾疾病/病因学/诊断 人类 -
磺柳酸法、尿液干化学分析仪法与双缩脲比色法检测尿蛋白定量的对比分析
目的:探讨尿蛋白定量在临床辅助诊疗肾脏疾病的可行方法,以进一步明确尿分析仪、磺柳酸法是否能替代双缩脲比色法进行尿蛋白定量的测定.方法:3种检测尿蛋白的方法即磺柳酸法、CLINITEK 500尿液干化学分析仪、双缩脲比色法,观察各组诊断总阳性率并统计其定量结果.结果:磺柳酸法、尿液干化学分析仪法、双缩脲比色法检测尿蛋白的阳性率分别符合临床诊断率为90%、93.9%、100%,并进行对比分析所测结果有统计学差异(P＜0.01).结论:3种检测尿蛋白的方法对临床诊断是可行的,但在尿蛋白量较大时,在结果的准确性上是有显著性差异的.
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慢性肾脏病76例尿蛋白成分与病理相关分析
目的:探讨慢性肾脏病患者的尿蛋白成分与不同病理类型之间关系.方法:76例肾病患者均接受了经皮肾穿刺活检术,对病理改变进行评分,采用散射比浊法行尿蛋白成分分析,检测患者的血肌酐、24 h尿蛋白定量,计算肾小球滤过率.结果:各种肾脏病中以硬化性肾小球肾炎患者的肾小球滤过率低而尿β2微球蛋白浓度高.轻微病变性肾炎患者的24 h尿蛋白定量高而尿白蛋白浓度也高.结论:各种肾脏病患者病理类型不同尿蛋白成分也有差异,对尿蛋白成分的分析可以评估肾脏病理损害的程度.
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CRP、ADA、LDH和TP联合检测对胸腔积液性质鉴别的价值
目的:探讨胸腔积液中的C反应蛋白(CRP)、腺苷脱氨酶(ADA)、乳酸脱氢酶(LDH)和总蛋白(TP)水平对胸腔积液鉴别诊断的价值.方法:检测95例不同病因引起胸腔积液的患者胸腔积液CRP、ADA、LDH和TP浓度.结果:结核组CRP和ADA平均含量为(27.14±21.72)U/L和(43.98±19.68)mg/L,显著高于癌症组和漏出液组(P＜0.01);癌症组LDH平均含量为(859.90±551.69)U/L,显著高于结核组和漏出液组(P＜0.01);漏出液组TP平均含量为(13.19±3.49)g/L,显著低于结核组和癌症组(P＜0.01).结论:检测胸腔积液中CRP、ADA、LDH和TP,有助于临床医生对胸腔积液性质的鉴别、形成的原因的诊断.
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肾母细胞瘤术前术后血清蛋白质谱差异性分析
目的:研究肾母细胞瘤患儿术前、术后血清蛋白质谱差异,检测术前、术后特异性蛋白质标记物来指导预后.方法:应用表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术结合支持向量机分析所有质谱数据并检测肾母细胞瘤息儿术前后血清蛋白质标记物的表达差异.结果:(1)30例术前标本与正常对照组比较:初步过滤筛选得到352个m/z峰,筛出m/z峰值位于6 984.O和6 455.0的蛋白质标志物2个,与正常组比较,患儿组此两峰处的蛋白质低表达.(2)24例手术前后血清蛋白质的比较:术前均呈低表达或不表达;21例根治术患儿术后2周标本高表达19例.低表达2例,3例姑息性切除患儿标本手术前后比较无变化;术后3个月和6个月跟踪复查时血清蛋白质在此两个峰值处无明显改变.(3)患儿术后2周中的19例根治术后与术前比较m/z峰值表达升高,与正常对照组比较表达稍低.结论:肾母细胞瘤特异性血清蛋白质标记物可以用于肾母细胞瘤的快速检测和监测预后,为患儿的预后提供新方法.
关键词： 肾母细胞瘤/外科学/血液 蛋白质类/分析 人类 儿童 -
不当操作对尿蛋白干化学法测定的影响分析
人正常情况下尿蛋白(protein,Pro)测定为阴性,当尿Pro超过100 mg/L或150 mg/24 h即为蛋白尿,它是肾脏疾病的重要诊断指标.干化学法检测尿液具有简单、快速、灵敏、准确等优点,在临床普遍应用,其原理是在多联试带上有数个含有各种试剂的膜块,各膜块与尿中相应成分进行独立反应而呈不同颜色,颜色深浅与尿中相应成分含量呈正比.尿潜血(occult blood,OB)膜块含有邻联甲苯胺、过氧化羟基异丙苯,Pro膜块含有酸碱指示剂溴酚蓝、枸橼酸盐缓冲液等.正确操作时,Pro膜块在上OB膜块紧邻在下两者互不干扰,当pH＞8.0或pH＜3.0,超过Pro试剂的缓冲作用时,可发生假阳性、假阴性[1],测定Pro适宜pH 5.0～8.0.
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树鼩肝细胞的分离和培养
目的观察体外培养的树鼩肝细胞形态结构和生物合成功能.方法采用体外两步灌流法分离树鼩肝细胞,用L15培养基予以培养,光、电镜下动态观察培养肝细胞形态结构,同时并检测不同时相点培养上清中清蛋白、总蛋白及甲胎蛋白的含量.结果该方法分离的肝细胞经台盼蓝拒染试验证实肝细胞即时存活率达90%以上,1 h～3 h肝细胞开始贴壁并伸展,同时可见双核细胞,培养3 d～10 d肝细胞相互接触,布满视野,肝细胞维持此状态至培养18 d.接种后1 d肝细胞合成清蛋白为6.8 g·L-1·d-1,7 d达峰值为12.8 g·L-1·d-1,并维持至14 d,以后逐渐减少至终止培养;培养1 d肝细胞的甲胎蛋白分泌量处于较高水平为3.45 mg·L-1·d-1,3 d达峰值为6.23 mg·L-1·d-1,以后逐渐减少,17 d检测不出.结论体外培养的树鼩肝细胞具有良好的形态结构和生物合成功能,能够满足肝炎病毒体外培养的需要,也为我们深入研究肝炎病毒复制机制创造了实验条件.
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Sep15人硒蛋白基因的克隆
目的:克隆人15×103硒蛋白(15×103 selenoprotein,Sep15)基因.方法:体外培养H9T淋巴细胞,裂解细胞获取总RNA,RT-PCR扩增人Sep15基因,再将其克隆到T载体上,序列测定并酶切鉴定重组体.结果:RT-PCR扩增得到大小约1 244 bp左右的基因片段,序列分析结果与Genbank上提交的人Sep15基因序列完全一致.Not I酶切鉴定得到3 015 bp左右的T载体片段及1 244 bp左右的人Sep15基因片段,与预期值相符.结论:成功克隆到人Sep15基因.
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利用组织芯片技术检测硒蛋白P在胃癌组织中的表达
目的:研究胃腺癌组织芯片中硒蛋白P的表达.方法:选用胃腺癌组织30例制备组织芯片,30例正常胃组织作为对照,用免疫组化的方法观察硒蛋白P在胃腺癌组织中的表达.结果:硒蛋白P在胃腺癌组织中的表达(17/30,56.7%)低于在正常胃组织中的表达(25/30,83.3%),二者差异有统计学意义,P=0.030;硒蛋白P在高、中分化病例中的阳性表达率为76.5%(13/17),高于低分化病例中表达率30.8%(4/13),二者差异有统计学意义,P=0.004;硒蛋白P在Ⅰ～Ⅱ期病例中表达为57.9%(11/19),Ⅲ期病例中表达为54.5%(6/11),二者差异无统计学意义,P=0.672.结论:硒蛋白P在胃腺癌组织中为低表达,与肿瘤的分化程度呈负相关,与肿瘤的TNM分期无关.
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蛋白质荧光标记技术应用
1 前言荧光物质是具有共轭双键体系化学结构的化合物,受到紫外光或蓝紫光照射时,可激发成为激发态,当从激发态恢复至基态时,发出荧光.
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小鼠卵巢蛋白质双向凝胶电泳蛋白谱系的初步建立及其功能分析
目的:初步建立性成熟小鼠卵巢蛋白质图谱,并对其中的蛋白质功能进行研究.方法:通过双向电泳和质谱技术分析性成熟小鼠卵巢蛋白质组,并对其中的一种蛋白质进行免疫组化研究.结果:(1)获得高重复性和高分辨率小鼠卵巢蛋白图谱.软件分析显示,3个不同卵巢样品24 cm银染蛋白凝胶上的蛋白点均有±2 000点,胶重复性好,大部分蛋白点位于相对相同的位置.(2)质谱共鉴定出52种蛋白质,按功能对其进行分类:参与细胞代谢、细胞信号传导/交流、细胞结构/运动、细胞/器官防御与抗氧化作用、调节RNA合成、调节蛋白表达及未分类.(3)通过对其中的一种蛋白(GRP78)行免疫组化分析,发现随着卵巢由卵泡早期逐渐生长到排卵前卵泡期成熟并转向黄体期,其在颗粒细胞中的表达信号增强.结论:(1)3个不同卵巢样品蛋白质双向电泳图重复性好.我们通过质谱分析共鉴定出约52种蛋白质,初步构建了小鼠卵巢双向电泳蛋白图谱,对研究卵巢病理与生理、发育过程有着重要的参考价值.(2)行免疫组化分析结果显示,在卵巢周期变化过程中,GRP78蛋白对颗粒细胞的增生、分化、形成黄体颗粒细胞起着重要的调控作用.
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人瘦素分离纯化的实验研究
背景:瘦素是脂肪组织产生的一种激素,具有广泛的生理作用,也是近年能量代谢研究的热点之一,所用瘦素主要是大肠杆菌的表达产物,后者以不溶解的包含体形式存在,需要通过烦琐的复性过程才能获得具有生物学活性的人瘦素.目的:为获得天然溶解形式的人瘦素,探索其非亲和层析纯化条件,为进一步可能的产业化提供依据.设计:实验观察.单位:一所医学院的生化教研室分子生物学实验室.材料:选择强阴离子交换剂(Sepharose Q)和疏水介质(Phenyl Sepharose 6)在条件下进行层析的方法,以尽可能除去样品中的杂质.方法:将培养获得的上清液在pH 7.5的条件下首先经过Q柱柱层析纯化,收集目的蛋白;随后在高盐[mol/L(NH4)2SO4]状态下通过疏水层析进一步纯化.主要观察指标:经凝胶扫描分析,纯化前的培养上清液人瘦素纯度为42.3%,Q柱柱层析纯化后纯度达到89.6%,疏水层析进一步纯化后纯度达到96.2%.结果:纯化产物在SDS-PAGE上呈现单一条带.经凝胶扫描分析,纯化前的培养上清液人瘦素纯度为42.3%,Q柱柱层析纯化后纯度达到89.6%,疏水层析进一步纯化后纯度达到96.2%.结论:通过强阳离子交换层析和疏水层析的合并应用,可将毕赤酵母表达系统表达的人瘦素进行有效纯化,纯度可达镍柱亲和层析的纯化结果,为进一步可能的产业化生产人瘦素提供了可靠依据和方法,为围绕瘦素的相关领域研究奠定了实验学基础.
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蚯蚓体质量和蛋白含量与1,8-二羟基蒽醌的作用
背景:蚯蚓是生态系统的重要组成部分之一,是陆生生物与土壤生态环境信息传递的桥梁,是一种非常重要的非靶标陆生土壤生物.经常用蚯蚓体质量和蛋白含量变化作为土壤毒理诊断的指标.目的:考察1,8-二羟基蒽醌在实验条件下对标准蚯蚓赤子爱胜蚓的相对生长速率和蛋白含量影响.设计:以实验动物为研究对象的实验研究.单位:一所大学的生态毒理实验室和基因工程实验室.材料:本实验于2004-02/2004-07在大连理工大学环境与生命学院生态毒理实验室和基因工程实验室完成.赤子爱胜蚓是国际蚯蚓实验标准蚓种,实验前先经预养,选择一二月龄、体质量200～300 mg的健康蚯蚓10条作供试动物.方法:实验开始前将蚯蚓置于湿润的滤纸上12 h,使其肠道内含物排除,然后冲洗,滤纸吸干,供试验用.将蚯蚓暴露于浓度不同的污染土壤中,每隔7 d测定蚯蚓体质量及溶解性蛋白含量.主要观察指标:1,8-二羟基蒽醌对蚯蚓蛋白含量及相对生长速率的影响.结果:高剂量的污染土壤(1.0 g/kg)对蚯蚓也无致死作用,但在所有剂量范围内,以相对生长速率和蛋白含量为指标的亚致死效应明显.1,8-二羟基蒽醌抑制蚯蚓生长的大量可达(-22.5%)(1.0 g/kg,接触时间28 d);降低蛋白含量的大程度可达39.6%(0.8 g/kg,接触时间7 d).结论:1,8-二羟基蒽醌对土壤生态系统生态安全性存在潜在危害,应对生产此类化工原料的生态风险进行充分的评估.
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兔牙本质磷酸蛋白稳定性及其生物学特性分析
背景:牙本质非胶原蛋白(NCPs)参与牙本质基质的矿化及第三期牙本质(tertiary dentin)的形成过程.牙本质磷酸蛋白(DPP)是其主要成分,为矿化组织稳定的关键因素.由于NCPs中存在多种蛋白水解酶体系,对DPP的稳定构成潜在威胁,因此推测NCPs中可能存在阻止蛋白质降解的物质系统.目的:探讨牙本质磷酸蛋白的稳定性及其形成机制.设计:非随机非对照研究.地点和对象:实验在武汉大学口腔医学院完成.对象为雄性日本长耳白兔75只,70～90 d龄,体质量2 000～2 200 g(中国科学院实验动物室提供).干预:从兔切牙牙本质非胶原蛋白NCP中提取DPP,应用凝胶过滤及离子交换层析技术纯化磷酸蛋白.主要观察指标:观察加入多种蛋白酶抑制剂时DPP降解的抑制作用.结果:钙离子能够启动DPP的降解系统,而该作用可被巯基蛋白酶抑制剂N-顺丁烯二酰亚胺(NEM)所抑制,从而阻止DPP分解.结论:NCPs中可能存在钙离子依赖性蛋白水解酶体系,能对牙本质层龋坏迅速扩展起修复作用.
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胎兔皮肤组织蛋白质组双向电泳技术的建立与分析
目的:胎兔皮肤蛋白质组的研究可能解开其无瘢痕愈合的机制,建立重复性好、分辨率高的胎兔皮肤组织蛋白质组双向电泳技术,初步分析寻找皮肤切割伤伤后胎兔蛋白质表达的差异.方法:本实验于2004-01/12在第三军医大学野战外科研究所完成.取孕20 d的新西兰大耳白兔、行宫内手术致胎兔皮肤全层切割伤,24 h后取致伤胎兔及其同胞未致伤胎兔背部皮肤,分别确定为致伤组和未致伤组,应用哺乳动物总蛋白提取试剂盒提取其总蛋白.应用双向电泳法将致伤组和未致伤组分别制成3块固相pH梯度胶条,电泳结束后硝酸银染色、图像扫描.同一胶条进行3次双向电泳,对所得图像进行蛋白质点、匹配率以及伤后蛋白表达差异的分析.结果:致伤组和未致伤组胎兔皮肤组织总蛋白分别分离出蛋白质点(105±14)个、(108±19)个,在两组中各选1块胶作为参考胶进行3块胶间的匹配,平均匹配点数分别是(88±8)个、(90±7)个,匹配率分别为84%、83%,同一样本3块胶上不同蛋白质点在第一向的位置偏差分别为(0.85±0.25)mm、(0.9±0.4)mm,在第二向的偏差分别为(1.25±0.5)mm、(1.5±0.5)mm.通过比对得到胎兔伤后表达增加的蛋白质点20个.结论:加大皮肤组织总蛋白上样量进行双向电泳得到重复性和分辨率均较好的电泳图谱,并初步找到伤后差异表达的蛋白质点,为无瘢痕愈后的深入实验研究打下基础.
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痹肿消汤干预胶原诱导性关节炎大鼠滑膜病变的蛋白质组学研究
目的:观察痹肿消汤干预胶原诱导性关节炎大鼠滑膜病变的蛋白质改变,分析痹肿消汤治疗类风湿关节炎可能的作用机制.方法:实验于2004-05/2005-02在中南大学湘雅医院中西医结合研究所实验室、卫生部肿瘤蛋白质组学重点实验室完成.70只SD大鼠随机分为3组,正常组10只,其余60只大鼠采用牛Ⅱ型胶原与完全福氏佐剂诱导SD大鼠实验性关节炎模型,选取造模成功者再随机分为两组,即痹肿消汤组和模型组.痹肿消汤煎液制备:白花蛇舌草15 g,肿节风30 g,丹参15 g,络石藤20 g,骨碎补15 g,苡米30 g等15味中药,双蒸水煎2次,30min/次,两煎混合,G4滤器过滤,于60℃水浴中浓缩成每毫升药液含生药116 g.痹肿消汤组灌服痹肿消汤煎液10 mL/kg(相当于生药62.1 g),2次/d灌服;模型组灌服生理盐水10 mL/kg,2次/d灌服.正常组自由进水.应用双向凝胶电泳技术分别分离正常组、模型组及痹肿消汤组大鼠关节滑膜的总蛋白后,经胶体考染显色、图像分析、识别差异表达的蛋白质点,应用MALDI-TOF-MS质谱仪得到相应的肽质量指纹图谱,然后搜索数据库鉴定部分差异蛋白质点.结果:纳入实验的70只大鼠,造模不成功被淘汰7只,终痹肿消汤组26只、模型组27只、对照组10只,共63只大鼠进入结果分析.①建立了正常组、模型组和痹肿消汤组关节滑膜的双向凝胶电泳图谱,其平均蛋白质点数分别为947±39,994±41,1031±52,其匹配率为92%,91%,94.2%.②发现并鉴定了正常组、模型组和痹肿消汤组大鼠滑膜的差异表达大于2倍的蛋白质点55个,这些差异表达蛋白质的功能涉及物质代谢、能量产生、物质转运、抗氧化应激、信号转导及细胞骨架蛋白,随即用免疫印迹的方法差异蛋白质annexin 1、aldolase A在正常组、模型组、痹肿消汤组中的表达,其结果也显示了类似的表达差异.结论:类风湿关节炎模型关节滑膜病变是一个多种蛋白质参与的复杂过程.滑膜组织的比较蛋白质组学分析是一种筛选病变相关蛋白的可靠方法之一.annexin 1、aldolase A可能与实验性关节炎的关节滑膜病变有关;痹肿消汤可能通过对实验性关节炎大鼠滑膜蛋白质表达的调控达到治疗目的.
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黑木耳超微粉蛋白质的营养价值研究
目的:探讨黑木耳超微粉蛋白质的营养价值.方法:采用化学分析方法测定实验材料酪蛋白、粗木耳、细木耳及超微木耳中蛋白质、粗脂肪、粗纤维、水分及灰分的含量,采用日立835-50型氨基酸自动分析仪测定蛋白质中必需氨基酸的含量,采用76-750型电感揭合等离子直读仪测定粗木耳、细木耳及超微木耳中无机盐的含量;将刚断乳的雄性Wistar大鼠,随机分成5组,即参比酪蛋白、粗木耳、细木耳、超微木耳及无氮饲粒组,每组10只,用AOAC建议配方纯合成的饲料(含蛋白质8%)喂养28 d,试验后4 d进行氮代谢试验.结果:黑木耳超微粉组的蛋白质真消化率、净利用率、生物学价值、功效比值分别与酪蛋白组比较差异均具有显著性(P＜0.05).结论:黑木耳超微粉蛋白质的营养价值较低.
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蛋白质定量中干扰因素的配伍组方差分析
目的:探讨总体分析分离菌体蛋白的部分常用试剂对染料结合法和二辛可宁酸法蛋白质定量方法的总体干扰作用.方法:配伍组方差分析法.结果:含EDTA和葡萄糖的分离试剂对二辛可宁酸蛋白微量定量方法干扰较强(P＜0.05),盐酸胍和尿素无干扰(P＞0.05);这些试剂对染料结合法蛋白微量定量方法无干扰(P＞0.05).结论:试剂对蛋白质定量的干扰作用不应忽视.
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硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株的建立及其差异表达蛋白的飞行时间质谱分析
目的:建立硼替佐米耐药的骨髓瘤细胞株,探讨硼替佐米敏感和耐药多发性骨髓瘤细胞株在蛋白质组水平上的差异.方法:采用硼替佐米浓度递增法诱导NCI-H929细胞株产生耐药株.采用流式细胞术比较亲本NCI-H929和NCI-H929B的细胞周期,双向电泳(2-DE)及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术分析两者间的差异蛋白表达情况.采用Western blot方法对部分鉴定结果进行验证.结果:采用浓度递增法自骨髓瘤细胞系NCI-H929建立了硼替佐米耐药株NCI-H929B.MTT法检测硼替佐米对亲本NCI-H929和NCI-H929B 24 h的IC50,其分别为20.7 nmol/L和487.4 nmol/L,耐药倍数为23.5.生长曲线及流式细胞术分析显示NCI-H929亲本和NCI-H929B的生长曲线和细胞周期分布无显著性差异.与亲本NCI-H929细胞的2-DE相比,NCI-H929B细胞中有11个蛋白点表达明显上调,6个明显下调.对这17个蛋白质点进行MALDI-TOF-MS分析,共获得了17个肽质量指纹图谱(PMF).将PMF质量数据通过Aldente软件查询SWISS-PROT数据库,根据匹配片段及氨基酸序列覆盖率等,初步鉴定出14种蛋白质.Western blot验证其中一种蛋白质(蛋白DJ-1),结果与双向电泳鉴定结果基本一致.结论:通过浓度递增法可建立硼替佐米耐药的骨髓瘤细胞株.双向电泳结果提示这些差异表达的蛋白质可能与多发性骨髓瘤对硼替佐米耐药的机制有关.
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细胞裂解液对蛋白质定量方法的影响
目的:观察不同细胞裂解液对Bradford法和bicinchoninic acid(BCA)法的影响,以确定适合蛋白质组学研究中细胞全蛋白含量的定量方法.方法:采用Bradford法和BCA法测定牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)样品溶液,样品BSA溶液分别由双蒸水和不同裂解液(荧光差异双向凝胶电泳裂解液、三种传统双向凝胶电泳裂解液)配制;然后,采用这两种方法测定上述裂解液所提取的细胞全蛋白样品;采用Bradford法定量反复冻融、不同比色杯和不同时期标准曲线下的样品.结果:各细胞裂解液对Bradford法均有显著性影响,使所定量的BSA浓度普遍偏高1.2至2倍,但定量值可随着加样浓度的增加而增加(r=0.989～0.996,P<0.05);各裂解液对BCA法也均有显著性的干扰,多数定量结果超出仪器读数范围;对于同批全蛋白溶液样品,BCA法的定量结果与Bradford法相比可有千倍差异;反复冻融后蛋白浓度变化统计学上无显著性差异,但有下降趋势,不同比色杯和不同时期标准曲线对Bradford法无显著影响.结论:Bradford法是蛋白质组学中细胞全蛋白定量的较适方法,但需根据具体实验进行优化.
