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梯度渗透压对大鼠内髓集合管细胞增殖的影响
目的 研究氯化钠梯度渗透压对内髓集合管(Inner medullary collecting duct,IMCD)细胞增殖的影响.方法 采用胶原酶消化和低渗溶解法分离培养SD大鼠原代IMCD细胞.在正常培养基中培养至90%以上细胞融合后,将细胞分为低渗(200 mosmol/kg),等渗(300 mosmoL/kg)和高渗(600 mosmol/kg)培养基组.在12 h和24 h分别应用MTT法(甲基噻唑基四唑)细胞毒性检测活细胞数目和流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率,评价细胞的梯度渗透压耐受性.结果 IMCD细胞有很强的渗透压耐受性,IMCD细胞在改变渗透压环境12 h时,高渗环境下细胞凋亡率显著高于低渗和等渗环境(1.1%±0.10% vs 0.565%±0.096%,P＜0.05;0.104%±0.08%,P＜0.05);而24 h时高渗环境下细胞凋亡率略低于低渗环境(P＞0.05),但仍高于等渗环境(P＞0.05).结论 高渗环境可以抑制IMCD细胞的生长,12 h作用较显著;而24 h低渗环境对IMCD细胞的抑制作用增加.
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速尿对家兔肾脏内髓集合管细胞Cl-/HCO3-交换的影响
目的评价速尿对家兔肾脏内髓集合管(IMCD)Cl -/HCO- 3交换功能的影响.方法采用荧光探针法测定不同浓度(15、30、60、120、240和480μmol/L)的速尿对家兔肾脏IMCD细胞单层Cl -/HCO- 3交换的影响.结果 15μmol/L的速尿溶液即可抑制IMCD细胞Cl -/HCO- 3交换,抑制率4.3%;480μmol/L的速尿溶液几乎完全抑制IMCD细胞的Cl -/HCO- 3交换,抑制率97.4%.随浓度的增加,抑制作用逐渐增强,速尿终浓度在30μmol/L以上时,各组的Cl -/HCO- 3交换显著低于对照组( P <0.01).结论速尿以剂量依赖的方式抑制家兔肾脏IMCD细胞Cl -/HCO- 3的交换.慢性呼酸患者使用速尿时应慎重.
关键词： 呋塞米 肾小管 集合 内髓集合管细胞 Cl -/HCO- 3交换 -
呼吸性酸碱失衡家兔肾脏内髓集合管细胞单层H+/K+交换功能及cH-K-ATP酶mRNA表达的实验研究
为了研究呼吸性酸碱失衡时内髓集合管(IMCD)细胞病理生理学改变,分别以3%CO2和10%CO2 模拟慢性呼碱和慢性呼酸家兔肾脏IMCD细胞培养模型,对照组用5%CO2.荧光探针法测定IMCD细胞H+/K+ 交换功能,原位杂交和RT-PCR检测IMCD细胞cH-K-ATP酶mRNA表达.结果显示,呼酸组H+/K+ 交换显著高于对照组(P<0.05),呼酸组cH-K-ATP酶mRNA原位杂交积分光密度和RT-PCR积分光密度比值均非常显著地高于对照组(P<0.01);而这三项指标,对照组与呼碱组之间差异均无显著性意义(P> 0.05).提示慢性呼酸显著增加IMCD细胞H+/K+ 交换和cH-K-ATP酶mRNA表达,慢性呼碱有抑制和下调趋势,但差异无显著性意义,其原因尚待进一步研究.
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囊泡型H+-ATPase B1亚基的突变对大鼠内髓集合管细胞H+-ATPase结构和泵氢功能的影响
目的 研究致遗传性远端肾小管酸中毒(dRTA)的囊泡型H+-ATPase B1亚基(ATP6V1B1)的点突变对大鼠内髓集合管(IMCD)细胞H+-ATPase结构和泵氢功能的影响.方法 模拟致人类遗传性dRTA的B1亚基点突变构建野生型(WT)和7种突变型(M)质粒,转染大鼠IMCD细胞并筛选稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)-B1 M和GFP-B1 WT的IMCD细胞系.应用免疫荧光、免疫蛋白印迹法、ATP-NADH耦合实验和快速酸负荷后不依赖钠的细胞内pH的变化,来观察GFP-B1 M和GFP-B1 WT在细胞内的分布,及其与H+-ATPase其他(E、H和C)亚基结合能力对ATP酶活性和H+-ATPase泵氢功能的影响.结果 GFP-B1 WT在转染细胞中呈囊泡样分布,与H+-ATPase的分布一致;而GFP-B1 M则为弥散分布.免疫沉淀结果显示只有GFP-B1 WT融合蛋白能和其他的H+-ATPase亚基(E、H和C)结合形成复合物,而CFP-B1 M融合蛋白无此作用.ATP酶活性只有在GFP-B1WT转染细胞株的免疫沉淀产物中存在,在GFP-B1 M转染细胞株的免疫沉淀产物中不存在.在CFP-B1 M转染的IMCD细胞快速酸负荷后H+-ATPase介导的钠不依赖pHi的恢复受到显著抑制[pHi的恢复率(pH U/min)在L81P、R124W、M174R、P275R、G316E、P346R、G364S GFP-BIM转染的IMCD细胞分别为0.007±0.002、0.004±0.002、0.002±0.002、0.003±0.002、0.006±0.004、0.009±0.004、0.015±0.006,P<0.05,n=51.而GFP-B1 WT转染的IMCD细胞pHi的恢复率与未转染IMCD细胞相似[(0.040±0.006)pH U/min],且能被1 μmol/L巴弗洛霉素(H+-ATPase特异性抑制剂)所抑制.结论 遗传性dRTA囊泡型H+-ATPase B1亚基点突变影响GFP-B1融合蛋白与其他亚基正常结合组装形成完整的H+-ATPase,并抑制H+-ATPase的泌酸功能.
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荧光探针法测定原代培养家兔肾脏内髓集合管细胞内pH
目的:建立稳定的原代培养肾脏内髓集合管(Inner medullary collecting duct,IMCD)细胞的pHi测定方法,为进一步研究IMCD细胞功能奠定基础.方法:将家兔肾脏IMCD细胞用盖玻片培养成细胞单层,制备IMCD细胞pHi标准曲线,然后测定IMCD细胞的BCECF/AM的荧光强度比值(FIR),进而将FIR转换为IMCD细胞的pHi.结果:本实验观察到IMCD细胞的FIR在pH 6.8～7.8范围内呈显著正相关,回归方程为y=0.848±1.089X(r=0.988,P<0.01).15份标本的pHi结果为7.255士0.030.与Mankus等报告的结果接近.结论:以上结果表明BCECF/AM荧光探针法测定IMCD细胞的pHi,具有简单、可靠、经济等优点,IMCD细胞pHi测定是研究IMCD细胞功能的基础测定之一.
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呼吸性酸碱失衡家兔肾脏内髓集合管细胞Cl-/HCO3-交换及阴离子交换蛋白2 mRNA表达的研究
目的研究肾脏内髓集合管(IMCD)细胞Cl-/HCO3-交换在呼吸性酸碱失衡时的代偿调节作用.方法分别以3%CO2和10%CO2模拟慢性呼吸性碱中毒(呼碱,ALG组)和慢性呼吸性酸中毒(呼酸,ACG组)建立家兔肾脏IMCD细胞培养模型,对照组(CG组)为5%CO2+空气平衡,采用荧光探针法测定IMCD细胞Xl-/HCO3-交换,用原位杂交和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测IMCD细胞肾脏阴离子交换蛋白2(KAE2)mRNA表达.结果ACG组Cl-/HCO3-交换[(0.132±0.015)pHi/min]显著高于CG组[(0.117±0.016)pHi/min,P＜0.05];CG组与ALG组[(0.111±0.015)pHi/min]无显著差别(P＞0.05).ACG组KAE2 mRNA原位杂交积分光密度(325.48±90.84)显著高于CG组(68.54±20.28,P＜0.01);CG组与ALG组(50.56±16.08)无显著差别(P＞0.05).ACG组KAE2 mRNA的RT-PCR积分光密度比值(2.24±0.36)显著高于CG组(0.43±0.05,P＜0.01);CG组与ALG组(0.37±0.05)无显著差别(P＞0.05).结论慢性呼酸显著增加IMCD细胞Cl-/HCO3交换和KAE2 mRNA表达,慢性呼碱略降低IMCD细胞Cl-/HCO3-交换和KAE2 mRNA表达.
关键词： 呼吸性酸碱失衡 内髓集合管细胞 Cl-/HCO3交换 阴离子交换蛋白2
