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囊泡型H+-ATPase B1亚基的突变对大鼠内髓集合管细胞H+-ATPase结构和泵氢功能的影响
目的 研究致遗传性远端肾小管酸中毒(dRTA)的囊泡型H+-ATPase B1亚基(ATP6V1B1)的点突变对大鼠内髓集合管(IMCD)细胞H+-ATPase结构和泵氢功能的影响.方法 模拟致人类遗传性dRTA的B1亚基点突变构建野生型(WT)和7种突变型(M)质粒,转染大鼠IMCD细胞并筛选稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)-B1 M和GFP-B1 WT的IMCD细胞系.应用免疫荧光、免疫蛋白印迹法、ATP-NADH耦合实验和快速酸负荷后不依赖钠的细胞内pH的变化,来观察GFP-B1 M和GFP-B1 WT在细胞内的分布,及其与H+-ATPase其他(E、H和C)亚基结合能力对ATP酶活性和H+-ATPase泵氢功能的影响.结果 GFP-B1 WT在转染细胞中呈囊泡样分布,与H+-ATPase的分布一致;而GFP-B1 M则为弥散分布.免疫沉淀结果显示只有GFP-B1 WT融合蛋白能和其他的H+-ATPase亚基(E、H和C)结合形成复合物,而CFP-B1 M融合蛋白无此作用.ATP酶活性只有在GFP-B1WT转染细胞株的免疫沉淀产物中存在,在GFP-B1 M转染细胞株的免疫沉淀产物中不存在.在CFP-B1 M转染的IMCD细胞快速酸负荷后H+-ATPase介导的钠不依赖pHi的恢复受到显著抑制[pHi的恢复率(pH U/min)在L81P、R124W、M174R、P275R、G316E、P346R、G364S GFP-BIM转染的IMCD细胞分别为0.007±0.002、0.004±0.002、0.002±0.002、0.003±0.002、0.006±0.004、0.009±0.004、0.015±0.006,P<0.05,n=51.而GFP-B1 WT转染的IMCD细胞pHi的恢复率与未转染IMCD细胞相似[(0.040±0.006)pH U/min],且能被1 μmol/L巴弗洛霉素(H+-ATPase特异性抑制剂)所抑制.结论 遗传性dRTA囊泡型H+-ATPase B1亚基点突变影响GFP-B1融合蛋白与其他亚基正常结合组装形成完整的H+-ATPase,并抑制H+-ATPase的泌酸功能.
