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自体骨髓单核细胞移植对急性心肌梗死的作用
目的 探讨未经诱导的自体骨髓单核细胞可否在梗死心肌环境中存活并分化为心肌细胞及血管内皮细胞.方法 40只日本大耳雄兔随机分为两组:移植组及对照组,每组各20只.采用结扎冠状动脉左前降支的方法建立急性心梗模型,以心电图证实模型成功,由超声心动图评价心功能.模型建立后7天,将BrdU标记的自体骨髓单核细胞注射到移植组动物心肌梗死区及周边区,而对照组动物相同部位仅注射等量生理盐水.移植后6周,收集动物心脏进行组织学及免疫组化分析.结果 抗BrdU免疫组化发现移植组动物心肌梗死区及周边区内均存在染色阳性的移植细胞,且周边区内的移植细胞呈心肌细胞及血管内皮细胞的形态特点,同时这些细胞抗心肌特异性肌动蛋白抗体染色阳性,证实其肌源性分化.另外,移植组动物梗死周边区血管密度显著高于对照组(P＜0.05),但两组动物在心肌梗死区内的血管密度没有统计学差异(P＞0.05).移植后6周,两组动物心功能均有改善,移植组明显优于对照组(P＜0.05).结论 自体骨髓单核细胞移植于梗死心肌后,可在梗死区及周边区存活,并在周边区分化为血管内皮细胞及具有心肌细胞形态特点的细胞、增加梗死周边区的血管密度,改善心功能.
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自体骨髓单核细胞移植治疗急性心肌梗死实验研究
目的探讨自体骨髓单核细胞(ABM-MNCs)移植至心肌梗死区及周边区后的存活、分化状况,以及对心功能的影响.方法将40只日本大耳雄兔随机分为细胞移植组和对照组各20只.采用结扎左冠状动脉前降支的方法建立急性心肌梗死(AMI)模型.细胞移植组于梗死后第6天于自体髂骨处抽取骨髓,分离得到单核细胞后,以Brdu标记,经心外膜注射到梗死区及周边区.对照组仅注射等量的生理盐水.移植6周后,进行组织学及免疫组织化学检查.结果移植后6周,两组动物的心功能均有改善,但两组间有显著性差异.Brdu标记示移植组梗死区内存在阳性染色的移植细胞,而周边区可见Brdu染色阳性的心肌细胞及血管内皮细胞.免疫荧光染色示梗死区内Brdu染色阳性的移植细胞抗心肌特异性肌动蛋白抗体阴性,而周边区内Brdu染色阳性的移植细胞抗心肌特异性肌动蛋白抗体阳性.对照组未发现Brdu染色阳性的细胞.移植组梗死周边区及远离梗死区的毛血管密度均高于对照组( P＜0.05),但梗死区内的毛细血管密度两组间无显著性差异( P＞0.05).结论 ABM-MNCs移植至急性梗死心肌后,可在梗死区内及周边区存活,并可在周边区分化为具有心肌功能的细胞及血管内皮细胞,增加梗死周边区的血管密度,改善心功能.
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M-CSF和RANKL联合诱导小鼠骨髓源破骨细胞形成的实验研究
目的 探索小鼠骨髓单核细胞佳诱导条件,以期提高破骨细胞(OC)的产生数量与纯度.方法 采用梯度离心法分离得到小鼠骨髓单核细胞.分别对首日刺激所用的巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的2.5ng/ml-160.0ng/ml 7个浓度、16h与24h两个处理时间.以及次日诱导所用的核因子K B受体活化因子配体(RANKL)和M-CSF12.5ng/ml-100.0ng/ml的16个浓度组合进行检测,比较OC产生的情况.以相差显微镜观察细胞形态变化,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法进行OC计数.结果 产生的体积大、TRAP染色阳性的多核细胞为OC.首日M-CSF刺激浓度为10ng/ml-20ng/ml组形成的OC数量多(P<0.05).处理16h组与24h组比较,OC形成率没有统计学差异(30.24±2.84个/孔vs31.22±3.25个/孔,P>0.05).次日诱导采用100ng/mlM-CSF+100ng/ml RANKL组的0C 得率高;在该条件下,OC数量在第9d达峰值,18d消失.结论 体外OC诱导分化的适宜条件为首先用10ng/ml M-csF将小鼠骨髓单核细胞刺激16-24h,然后用100ng/mlM-CSF+100ng/ml RANKL对非贴壁细胞联合诱导9d.
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自体骨髓单核细胞移植在肝纤维化兔肝脏内的定植能力
目的 建立四氯化碳诱导的兔肝纤维化动物模型,观察体外分离标记的自体骨髓单核细胞(ABM-MNCs)经肠系膜上静脉自体移植至肝纤维化区及周边区后的存活、定植状况.方法 将40只普通级日本大耳家兔随机分为细胞移植组和对照组各20只,实验组腹腔注射40%CCl4橄榄油溶液建立肝纤维化模型,对照组腹腔注射等量生理盐水.细胞移植组于模型稳定后自体髂骨处抽取骨髓,采用氯化氨红细胞溶解法分离得到单核细胞,以5溴-2脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记体外ABM-MNCs及鉴定;分离培养ABM-MNCs,将3×109个ABM-MNCs经肠系膜上静脉回输体内,对照组回输等量生理盐水,移植前、移植后3、7、14、21 d分别取肝组织固定,进行免疫组织化学检测.结果 BrdU体外标记ABM-MNCs的免疫组织化学表现示:20 μmol/L BrdU孵育ABM-MNCs 72 h的阳性标记率达95%;肝组织20 μmol/L BrdU免疫组化染色切片显示:自体骨髓单核细胞移植后第3天,肝小叶中央静脉周围BrdU染色阳性,随着时间的推移,阳性染色逐渐增强,并逐步向肝组织内部延伸.阳性染色主要分布于肝组织汇管区周围组织,而对照组BrdU染色则阴性.结论 ABM-MNCs经肠系膜上静脉移植后,可在纤维化区及周边区存活,定植.
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破骨细胞骨吸收中肿瘤坏死因子α可提高空泡型质子泵表达与活性
背景：空泡型的ATP酶(V-ATPase)在破骨细胞的骨吸收功能中起重要作用，肿瘤坏死因子α对破骨细胞中的V-ATPase表达与活性的影响尚不明确。
目的：通过V-ATPase的表达与酶的活性变化，探讨肿瘤坏死因子α促进破骨细胞骨吸收功能的机制。
方法：体外诱导培养破骨细胞，分别给予不同质量浓度的肿瘤坏死因子α干预(5，10，30μg/L)。采用荧光定量 PCR 及 Western Blot 检测肿瘤坏死因子α对破骨细胞 V-ATPase 表达的影响；根据吸光度值计算出V-ATPase的相对活性；倒置显微镜下观察骨吸收陷窝形成情况，采用Image J软件分析骨吸收面积。
结果与结论：破骨细胞经过48 h的肿瘤坏死因子α干预以后，V-ATPase的表达与活性均有显著的增加，并且提高肿瘤坏死因子α的干预浓度均可增强此效应。破骨细胞经肿瘤坏死因子α干预后，培养板的骨吸收面积明显增加，这种作用随着肿瘤坏死因子α干预浓度的增加而增强。由此推测肿瘤坏死因子α作为一个重要的炎症递质参与病理性骨质吸收的过程，除促进破骨细胞形成以外，其可能的机制是肿瘤坏死因子α通过增加V-ATPase的表达，并提高V-ATPase活性，从而增强破骨细胞的骨质吸收活动。 -
C57BL/6小鼠骨髓单核细胞分离、培养、纯化及向破骨细胞的分化
背景：目前骨髓单核细胞的分离提取国内外文献报道，大多是利用RAW264.7细胞诱导分化为破骨细胞。目的：探讨分离、培养、纯化和鉴定C57BL/6小鼠骨髓单核细胞的方法，观察小鼠骨髓单核细胞体外生长特征，诱导其向破骨细胞分化。方法：无菌分离C57BL/6小鼠股骨和胫骨，取出骨髓细胞，提取过程中先用红细胞裂解液去除红细胞；骨髓细胞过夜培养后(大于16 h)，第2天分离出悬浮细胞，在含有巨噬细胞集落刺激因子的培养基中继续培养获得贴壁的小鼠骨髓单核细胞。通过换液对小鼠骨髓单核细胞进行纯化和扩增培养。进行形态学观察，测定生长曲线，用流式细胞仪检测原代小鼠骨髓单核细胞细胞表面抗原，加入巨噬细胞集落刺激因子和核因子κB受体活化因子配基诱导分化为破骨细胞。结果与结论：新分离的小鼠骨髓单核细胞呈小圆形，两端伸出触角，培养5 d后，细胞成椭圆形，两端的触角更明显，增殖依赖巨噬细胞集落刺激因子。流式结果显示分离的小鼠骨髓单核细胞纯度较高，能够诱导分化为破骨细胞。利用间充质干细胞与单核细胞的贴壁能力不同及巨噬细胞集落刺激因子显著促进单核细胞贴壁增殖的特性能有效分离获得稳定生长的小鼠骨髓单核细胞。培养的小鼠骨髓单核细胞性状稳定，表型稳定均一，适于做进一步研究。
关键词： 干细胞 培养 骨髓单核细胞 破骨细胞 巨噬细胞集落刺激因子 核因子κB受体活化因子配基 鉴定 分化 药物贴壁筛选法 -
晚期氧化蛋白终产物对破骨细胞分化的影响
目的：探讨晚期氧化蛋白终产物（ AOPPs）对破骨细胞分化的影响。方法体外分离培养大鼠骨髓单核细胞，分为空白对照组、阴性对照组（ RSA）、AOPPs组、阳性对照组（RANKL）、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶抑制剂组（AOPPs＋夹竹桃麻素），干预6 d后，通过抗酒石酸酸性磷酸酶（ TRAP）染色观察TRAP阳性多核细胞，鬼笔环肽荧光染色观察F肌动蛋白（ F-actin）环，甲苯胺蓝染色观察骨磨片的骨吸收陷窝。此外，AOPPs刺激2 h后，通过DCFH-DA荧光探针法检测细胞内活性氧（ ROS）生成。结果 AOPPs 及阳性对照组 RANKL 均可诱导 TRAP阳性多核细胞、F-actin环及骨吸收陷窝形成，并且AOPPs刺激后细胞ROS生成明显增多。 AOPPs所致以上效应均能被NADPH氧化酶抑制剂夹竹桃麻素阻断。结论 AOPPs可诱导大鼠骨髓单核细胞向破骨细胞分化。
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骨髓单个核细胞移植治疗急性心肌梗死的实验研究
目的 探讨大鼠急性心肌梗死(AMI)后骨髓单核细胞(BMMNCs)移植对心功能的影响及其可能机制.方法 利用密度梯度离心法获取BMMNCs,并用4',6-二脒-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)标记,结扎大鼠前降支,建立AMI动物模型,分别于AMI后1 h(n=10)及1 w(n=10)梗死中央及周边局部注射BMMNCs(2×107个,0.2 ml),对照组(n=10)AMI后1 h局部注射等量生理盐水,AMI后8 w心脏超声检测3组大鼠心脏功能,然后取材,进行荧光检查及组织学检查.结果 AMI 1 w移植组左室收缩功能明显高于其他两组,荧光检查结果显示所有切片中均未发现DAPI标记的细胞;HE染色血管计数结果显示AMI 1 w移植组梗死局部毛细血管密度明显高于其他两组,其非缺血区域心肌细胞调亡则明显低于其他两组.结论 大鼠AMI 1 w后BMMNCs移植可以增加梗死局部血管新生,改善心梗后心功能,减少非缺血区域心肌细胞凋亡,其心功能改善及血管新生与BMMNCs的横向转化无关.
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骨髓单核细胞移植促进大鼠急性心肌梗死后局部血管新生
目的 探讨大鼠急性心肌梗死(AMI)后骨髓单核细胞(BMMNCs)移植对心功能和梗死局部血管新生的影响及其可能的机制.方法 利用密度梯度离心法获取BMMNCs,并用4',6-二脒-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)标记,结扎大鼠左冠脉前降支血管,建立AMI动物模型,分别于心肌梗死后l h及1 w于梗死中央及周边局部注射BMMNCs(2×107个/ml,0.2 ml),对照组AMI后1 h局部注射等量生理盐水,AMI后8 w心脏超声检测3组大鼠心脏功能,然后取材,进行荧光检查及组织学检查.结果 心梗1 w移植组左室收缩功能明显高于其他两组,荧光检查结果显示所有切片中均未发现DAPI标记的细胞;HE染色血管计数结果显示心梗1 w移植组梗死局部毛细血管密度明显高于其他两组.结论 大鼠AMI 1 w后BMMNCs移植可以增加梗死局部血管新生,改善心梗后心功能,而心功能改善及血管新生与BMMNCs的横向转化无关.
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粒细胞集落刺激因子神经保护作用的研究进展
粒细胞集落刺激因子(Granulocyte Colony-Stimulating Factor,G-CSF)首先发现于1980年,Metcalf等在研究中发现内毒素处理过的小鼠血清或者条件培养基中的一种活性成分,这种成分具有诱导小鼠骨髓单核细胞白血病细胞集落分化的功能[1],被命名为粒细胞-巨噬细胞分化因子(Granuloycyte-Macrophage Differentiation Factor,GM-DF),此后研究发现它能在体外选择性地刺激造血前体细胞分化为粒细胞集落,因此将它改称为G-CSF.
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枸杞多糖对电离辐射所致小鼠骨髓单核细胞凋亡的抑制作用
[目的]探究枸杞多糖对X射线所致的小鼠骨髓单核细胞(BMNCs)凋亡的作用机制.[方法]体外培养BMNCs,建立放射损伤细胞模型.X射线照射后枸杞多糖组立即给予100、200、400、800μg/mL枸杞多糖,辐射对照组和正常组给予等量不合枸杞多糖的RPMI1640培养液,分别于照射后24、48、72、96h采用MTT法检测细胞活力,用流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率,用JC-1荧光探针法检测细胞线粒体膜电位,用分光光度法检测细胞中半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3活性,用蛋白免疫印迹法检测B淋巴细胞瘤(Bcl)-2和细胞色素C的表达.[结果]照射后24h,与辐射对照组相比:枸杞多糖各组和正常组细胞活力均升高(P＜0.01);枸杞多糖各组和正常组细胞凋亡率分别降低5.95％、5.84％、5.33％、3.96％、5.48％(P＜0.01);200、400、8000μg/mL枸杞多糖组和正常组线粒体膜电位下降的细胞数占总细胞数的比例明显减少(P＜0.01)(分别减少5.79％、10.16％和11.21％、19.01％);枸杞多糖各组和正常组Caspase-3活性下降(P＜0.05);400、800 μg/mL枸杞多糖组和正常组Bcl-2的表达明显升高(P＜0.05),细胞色素C的表达量明显下降(P＜ 0.05).[结论]枸杞多糖对X射线所致的小鼠骨髓单核细胞的凋亡有抑制作用,可能是通过作用于Caspase-3,细胞色素C和Bcl-2所在的线粒体途径来实现.
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1, 25二羟基胆钙化醇诱导大鼠骨髓单核细胞向破骨细胞转化的机制
目的:探讨1,25二羟基胆钙化醇(1,25(OH)2D3)诱导大鼠骨髓单核细胞向破骨细胞转化时明胶酶表达及其参与骨陷窝形成机制.方法:分离乳鼠骨髓内细胞,诱导生成破骨样细胞.姬姆莎、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鉴定.扫描电镜观察诱导出的细胞贴附于骨片上形成的骨陷窝,明胶酶谱检测细胞培养液中明胶酶表达水平. 结果:单核细胞经1,25(OH)2D3诱导,第9日生成大量的破骨样细胞.姬姆莎染色显示出多核(≥3个), TRAP染色阳性,扫描电镜观察破骨细胞在骨片上培养时产生骨陷窝.1,25(OH)2D3组基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达水平增加显著.结论:1,25(OH)2D3诱导单核细胞产生大量破骨细胞.参与骨陷窝形成的明胶酶是MMP-2.这可能是破骨细胞通过某些机制,促进其他非破骨细胞分泌有活性的MMP-2参与噬骨.
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小鼠骨髓间充质干细胞、骨髓单核细胞和胚胎成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞的效率比较
目的 比较小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)、小鼠骨髓单核细胞(BM MNCs)和小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)重编程为诱导性多能干细胞(iPS细胞)的效率.方法 用慢病毒LV-ef1a-mOct-IRES-EGFP、LV-ef1a mSox2-IRES-EGFP、LV-ef1a-mKlf4-IRES-EGFP和LV-ef1a-mc-Myc-IRES-EGFP感染BMSCs、BM-MNCs和MEFs,通过计算碱性磷酸酶染色阳性克隆数比较这3种细胞重编程为iPS细胞的效率.用胚胎干细胞表面标记检测、胚胎干细胞内源基因检测、拟胚体形成实验和畸胎瘤形成实验验证重编程获得的iPS细胞的多能性.结果 起源于小鼠BMSCs、BM-MNCs及MEFs的3种iPS细胞均能形成边缘光整的致密克隆,可表达干性基因Nanog、Rex-1、SSEA-1,并能在体内外分化为三胚层组织.但是BMSCs来源的碱性磷酸酶阳性克隆数低于BM MNCs和MEFs来源的克隆数.结论 小鼠BMSCs、BM-MNCs及MEFs均可重编程为iPS细胞,但BMSCs重编程为iPS细胞的效率低于BM-MNCs和MEFs.
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骨髓单核细胞移植对大鼠心肌梗死后血流动力学的影响
目的:评价局部骨髓单核细胞移植对大鼠缺血心肌血管生成作用及对血流动力学的影响.方法:将Lweis大鼠26只随机分为移植组(n=14)及对照组(n=12),结扎大鼠左冠脉管降支,建立急性心肌梗死模型.将新分离的骨髓单核细胞注射到大鼠的缺血心肌中,术后4周观察心肌血管数目,结合心脏血流动力学参数评价心功能的改善情况.结果:4周后血流动力学检测移植组相比对照组左心室舒张末期压力降低,有统计学意义(P＜0.01);压力变化率大值(dp/dt)升高,有统计学意义(P＜0.01).骨髓单核细胞心肌内移植的大鼠中,毛细血管密度大大增加,移植组和对照组心肌血管数分别为23.1±1.5个/HPF vs 10.5±1.8个/HPF,P＜0.01.结论:局部移植骨髓单核细胞能明显促进缺血心肌新生血管生成,增加缺血区灌注,并可在一定程度上改善血流动力学.
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细胞因子与骨质疏松的实验研究
目的探讨细胞因子白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子（TNF）与骨质疏松发生的关系。方法以去势后雌性SD大鼠为模型，分去势组、假手术组和去势加利维爱组，共三组，对照研究骨密度（BMD）和骨髓微环境中IL-6和TNF的含量变化。结果骨髓单核细胞具有分泌TNF和IL-6作用；卵巢分泌性激素水平下降可导致骨髓单核细胞TNF和IL-6基因表达调节失控；去势后大鼠体内TNF和IL-6水平与BMD呈负相关。结论提示TNF和IL-6的水平升高是引起骨丢失的机理之一，卵巢分泌性激素对TNF和IL-6具有下调作用。
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自体骨髓单个核细胞移植治疗急性心肌梗死患者的护理
采用自体骨髓单个核细胞经冠状动脉移植(MBMC)治疗急性心肌梗死患者28例,结果术中注入细胞悬液后出现少数自限性室性早搏1例、寒战2例,术后穿刺点出血2例,尿潴留3例.认为重视术前心理护理和术中配合,强调术后心电及动脉压监测,加强骨髓移植不良反应观察、体位护理、穿刺部位出血观察及排尿护理,有利于减少术后并发症的发生,对促进患者的康复有积极作用.
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骨髓单核细胞移植对脊髓横断大鼠神经营养因子-3和突触素表达的影响
目的：探讨骨髓单核细胞（BMMNCs）移植对脊髓横断（SCT）大鼠脊髓组织中神经营养因子-3（NT-3）和突触素（SYN）表达的影响。方法：146只Winstar大鼠（SPF级，雌雄不限）随机分为3组：SCT组49只，建立SCT模型；实验组49只，建立SCT模型，给予BMMNCs移植治疗；假手术组48只，切除对应的椎板不损伤脊髓；各组大鼠分别于术后5、7、14和21d行后肢功能BBB评分，RT-PCR和免疫组织化学技术检测受损脊髓组织中 NT-3和SYN的表达。结果：术后5、7、14和21d各时间点各组大鼠后肢BBB评分比较，SCT组和实验组均低于假手术组（P＜0．05），且SCT组更低于实验组（P＜0．05）。术后5、7、14和21d各时间点NT-3阳性细胞数及NT-3 mRNA比较，SCT组和实验组均高于假手术组（P＜0．05），且SCT组更低于实验组（P＜0．05）。SYN阳性颗粒数及SYN mRNA比较，SCT组和实验组均低于假手术组（P＜0．05），且SCT 组更低于实验组（P＜0．05）。结论：BMMNCs能够上调局部损伤脊髓NT-3和SYN的表达。
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治疗性血管新生:防治心肌无复流的新策略
急性冠状动脉综合征患者接受再灌注治疗后,由于微循环功能障碍常会发生无复流现象,严重影响患者的预后.治疗性血管新生通过多种机制修复微血管、改善微循环障碍,为心肌无复流的防治带来新启示.本文就无复流发生机制,以及治疗性血管新生的防治效果和机制进行讨论.
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骨髓单核细胞移植对脑出血小鼠脑损伤程度与神经功能的影响
目的 观察骨髓单核细胞(BM-MNCs)移植对脑出血小鼠脑损伤体积、脑组织含水量及神经行为学等的影响.方法 按完全随机数字表法将72只成年雄性C57BL/6小鼠分为假手术组、溶剂治疗组与BM-MNCs移植组.采用胶原酶立体定位注射法制作脑出血小鼠模型、梯度离心法分离小鼠股骨骨髓腔中的单核细胞;通过尾静脉注射方法移植BM-MNCs,溶剂治疗组给予等体积的生理盐水注射.勒克司坚牢蓝(Luxol fast blue)染色检测脑损伤体积,干湿重法检测脑组织含水量,并通过改良神经功能缺损程度评分(mNSS)评价小鼠神经功能变化.结果 经BM-MNCs移植治疗后,脑损伤体积(3.01 ±1.17) mm3、脑组织含水量(78.930±1.125)％均明显下降,与溶剂治疗组比较,脑损伤体积为(4.51±1.84) mm3,脑组织含水量为(81.520±1.181)％,差异有统计学意义(P＜0.05).mNSS显示,除假手术组外,其余小鼠均有不同程度的神经功能缺损;经BM-MNCs移植治疗后,其神经功能明显改善,与溶剂治疗组比较差异亦有统计学意义(F=6.373,P＜0.05).结论 BM-MNCs移植治疗可以显著减轻脑出血后的脑损伤程度并促进脑出血小鼠神经功能的恢复.
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骨髓单核细胞与缺血性心脏病
缺血性心脏病是临床心血管内外科常见疾病，因局部心肌缺血导致心肌损伤降低心功能。恢复缺血心肌血流和恢复心肌组织细胞数量是缺血性心脏病防治的主要突破口。干细胞是恢复心肌组织细胞数量的主要手段：骨髓单核细胞是一种多成分多功能的细胞混合物，具有多向分化潜能，在缺血性心脏病治疗中具有重要意义。本文主要从骨髓单核细胞的成分及其在缺血性心脏病防治中的作用及机制进行阐述。
