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神经支架修复面神经缺损的研究进展
面神经属于周围神经系统，为混合神经，其含有运动神经和感觉神经，并以运动功能为主，支配面部表情肌肉的运动。由于外伤、肿瘤以及医源性等因素，面神经易受到影响而造成缺损，使患者面部表情运动受到限制，甚至造成不可逆的损伤，从而在生理和心理上造成对患者的双重影响，使患者的生活质量下降。有关面神经损伤后修复一直为临床上迫切需要解决的难题之一。1988年，Lundborg发现不同于中枢神经系统不能在创伤后进行自主恢复，周围神经，可在一定程度的范围内进行自我修复。利用这一特点，神经移植术被广泛应用于面神经缺损修复中［1］。目前，自体神经移植已经成为周围神经缺损外科修复的金标准［2］。但自体神经移植来源一般较困难，以及可能会造成供区的二次伤害，因而这种方法的应用受到了一定程度的限制。近几十年来，随着显微技术的发展，学者们对不同种类的生物材料或自体非神经材料进行研究，尝试进行面神经缺损的修复，从而代替自体神经移植，以达到神经功能恢复的目标［3-5］。随着组织工程学的发展，建立在神经营养和趋化学说基础上的神经导管修复法在面神经缺损修复方面逐渐得到人们的重视［6］。
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周围神经损伤后修复再生的研究进展
周围神经损伤是手显微外科的常见病，其治疗及功能恢复一直都是手显微外科的难题。周围神经缺损后如何促进再生修复，提高神经缺损的治疗效果，使患者功能恢复较好，一直是临床研究的重点、热点、难点。近年来随着基础研究的不断深入，人们对周围神经解剖及其再生微环境的认识，周围神经损伤治疗方法已经由药物治疗、手术治疗发展到基因工程等，为周围神经损伤患者的治疗提供了更好的治疗思路。本文就周围神经缺损后周围神经修复的方法作一综述。
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神经支架中梯度信号制备方法研究进展
从过去的几十年至今，在材料表面制备物理或者化学图案一直是研究的热点，同时也涌现出大量制备图案的方法。例如，不同的光刻技术就可以满足二维和三维材料从纳米到厘米尺度的图案设计[1]。许多方法可以在材料表面制备可控的物理或者化学图案，但是却在图案的边缘留下了明显的界限。然而，在一些特定的应用中需要这些图案呈现时间或者空间上的渐变性，也就是使这些图案具有梯度变化的趋势[2]。
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胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的施万细胞复合胶原-壳聚糖神经支架对大鼠坐骨神经缺损的修复作用
目的 探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因修饰的施万细胞复合胶原-壳聚糖神经支架移植对大鼠坐骨神经长距离缺损的修复作用.方法 建立大鼠左侧坐骨神经8 mm缺损模型,并随机分为3组,分别给予GDNF基因修饰的施万细胞复合胶原-壳聚糖多孔支架移植(GDNF-Sch组)、施万细胞复合胶原-壳聚糖多孔支架移植(Sch组)和自体神经移植(对照组),每组6只.分别于术后第3、6、12周行坐骨神经功能指数(SFI)检测,并在术后第12周解剖暴露桥接段坐骨神经行再生神经形态学和电生理检测,并测量胫前肌湿重.结果 术后6和12周,3组大鼠术侧SFI间差异有统计学意义(P均＜0.05),随着治疗时间延长,GDNF-Sch组SFI恢复情况更接近于对照组,明显优于Sch组.术后12周,GDNF-Sch组和Sch组的感觉神经传导速度明显低于对照组(P＜0.05),两组间差异无统计学意义(P＞0.05);GDNF-Sch组和Sch组的感觉神经波幅也明显低于对照组(P＜0.05),GDNF-Sch组则明显高于Sch组(P＜0.05);GDNF-Sch组和对照组的运动神经传导速度和波幅均明显高于Sch组(P均＜0.05),但两组间差异均无统计学意义(P均＞0.05).术后12周,对照组、Sch组和GDNF-Sch组大鼠桥接侧胫前肌湿重分别为(0.360±0.020)、(0.250±0.018)和(0.310±0.025)g,均明显低于对照侧(0.440±0.031)、(0.420±0.024)和(0.430±0.027)g(P均＜0.05);GDNF-Sch组和对照组桥接侧胫前肌湿重均明显高于Sch组(P均＜0.05),但两组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 GDNF基因修饰的施万细胞复合胶原-壳聚糖神经支架能够显著增强大鼠坐骨神经长距离缺损的修复作用,这种修复效果与自体神经移植术相似.
关键词： 坐骨神经 修复 胶质细胞源性神经营养因子 神经支架 -
神经支架复合体修复周围神经缺损
目的探讨壳聚糖与琼脂糖水凝胶载体及外源性神经生长因子联合制成组织工程神经支架复合体修复大鼠周围神经缺损的可行性.方法壳聚糖与琼脂糖水凝胶载体及外源性的神经生长因子结合,制备成新型的组织工程神经支架复合体,修复大鼠坐骨神经10 mm缺损,术后16周进行免疫组织化学等再生神经形态学观察.用单纯壳聚糖导管和自体神经分别作为阴性、阳性对照.结果复合支架组的神经再生数目和直径均优于单纯壳聚糖导管组(P＜0.01),与自体神经移植组相当.结论壳聚糖与琼脂糖水凝胶载体及外源性的神经生长因子结合,制备成的组织工程神经支架复合体对大鼠神经再生提供良好的再生微环境,可明显促进神经再生,效果接近自体神经移植水平.
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周围神经损伤与再生:新型修补材料的应用研究与进展
背景:虽然自体神经移植是当前治疗大段神经缺损的金标准,但因其应用受到诸多限制,因此科学家从未放弃探索新型神经修补材料.目的:回顾近年来周围神经损伤领域产生的新观点、再生过程中的关键细胞及新型神经导管的应用.方法:由第一作者检索2001至2016年PubMed数据库收录的与组织工程神经支架材料相关的文献,检索词为"peripheral nerve injury,peripheral nerve regeneration,nerve scaffold",按纳入、排除标准后共纳入文献76篇进行综述.结果与结论:周围神经的修复主要集中在如何让再生的神经长得"快"与长得"准"上,未来除了应继续拓展开发生物相容性更好的材料外,还应优化设计,在分子细胞和组织层面多层次模拟神经再生微环境,模拟建立取向纳米结构、化学组分、生物信号时空分布等多重仿生神经移植物.应明确的是,神经导管不应只是简单的力学支撑,还应具有一定功能,如导电、细胞因子梯度缓释等.仿生也不应只局限于形态学上,还应拓展到如细胞因子的时空变化、细胞生物电刺激等方面上来.
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扫描电镜观察组织工程神经支架与骨髓间充质干细胞的共同培养
目的:扫描电镜观察骨髓间充质干细胞在组织工程神经支架中生长、附着状态,探讨骨髓间充质干细胞与该支架细胞的亲合性.方法:实验于2006-02/2006-12在中国医科大学神经解剖研究室完成.实验材料:180～200 g成年清洁级健康雄性wistar大鼠,用于制备无细胞神经移植物,100～120 g成年清洁级健康雄性wistar大鼠,用于制备骨髓间充质干细胞,均由中国医科大学实验动物部提供(SCXK(辽)2003-0009).实验方法:①无细胞神经移植物的制备:参考刘承吉等组织工程化天然神经支架制备方法制备无细胞神经移植物.②骨髓间充质干细胞的体外培养与鉴定:无菌条件下分离wistar大鼠股骨、胫骨,用低糖DMEM培养液反复冲洗骨髓腔,收集冲洗液,1 000 r/min 4℃离心10 min,去上清液,DMEM培养液重悬细胞,置于37℃、体积分数为0.05的CO2孵箱内培养,24 h半量换液,48 h全量换液,每二三天换液1次,5～7 d后达到80%融合,0.25%胰酶消化,离心,按1:2传代培养,留取3代备用.采用免疫组织化学染色法鉴定.③骨髓间充质干细胞植入并与无细胞神经支架联合培养:手术显微镜下将1×107L-1骨髓间充质干细胞多点注入无细胞神经支架内,见支架膨胀隆起后,将支架重新放人培养液内培养7 d.④实验评估:将制备的无细胞神经移植物横断面进行扫描电镜观察,骨髓间充质干细胞接种于支架上混合培养7 d后,对移植物支架进行扫描电镜观察.结果:①免疫组织化学法鉴定骨髓间充质干细胞:培养的细胞不表达CD34、CDl4,表达CD44、CD29,说明实验中分离、培养的细胞不是造血干细胞而是骨髓间充质干细胞.②扫描电镜观察无细胞神经移植物与移植物支架:无细胞异体神经支架在扫描电镜下见正常神经的髓鞘、轴突均消失,仅剩下空虚呈网格状的施万细胞基底膜管.联合培养7 d后骨髓间充质干细胞在基底膜管内均匀分布,在管腔内贴附生长,细胞呈椭圆形或多突起形.骨髓间充质干细胞在该支架内均匀分布,并伸出伪足贴附于该支架内.结论:骨髓间充质干细胞在组织工程神经支架内生长良好,形态正常,并伸出伪足与管壁粘连紧密,该支架对骨髓间充质干细胞具有良好的细胞亲合性.
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壳聚糖神经支架复合免疫性脱髓鞘剂修复长节段神经缺损研究
目的 探讨壳聚糖神经支架复合免疫性脱髓鞘剂修复长节段神经缺损临床效果.方法 选取成年SD雌性大鼠48只,将其分为神经支架+免疫脱髓鞘剂注射组、神经支架组及自体神经修复组,每组各16只.使用壳聚糖神经支架复合抗半乳糖神经酰胺抗体(Gal-C抗体)及豚鼠补体脱髓鞘剂治疗大鼠坐骨神经12 mm缺损.于第8、12周,观察各组大鼠的NF-200和S-100免疫组化染色情况、坐骨神经指数(SFI),以及再生神经的面积、神经元数量、有髓神经的平均直径.结果 第8、12周时,神经支架+免疫脱髓鞘剂注射组的S-100、NF-200标记物的走形和分布明显优于神经支架组,但稍差于自体神经修复组(P<0.05).透射电镜显示出同样的趋势,神经支架+免疫脱髓鞘剂组的再生神经面积、有髓神经数量、有髓神经平均直径在12周时均优于神经支架组(P<0.05).SFI指数证实神经支架+免疫脱髓鞘剂注射组的患肢运动功能恢复明显优于单纯支架组(P<0.05).结论 采用壳聚糖神经支架复合免疫脱髓鞘剂进行长节段神经缺损治疗能够明显提高神经生长速度,促进神经再生,可成为新型治疗神经缺损的方法.
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几种神经支架原材料的生物力学性质评价
组织工程支架都需要有一定的力学性能以满足实际使用时的要求.本文考察了9种候选神经支架原材料的力学性能,为神经支架的设计制作的选材提供力学依据.本研究以PLGA、胶原、海藻酸钠、脱细胞猪皮、脱细胞血管、脱细胞猪皮-PLGA的复合体、脱细胞血管-PLGA的复合体以及经改性的壳聚糖和明胶作为考察材料,用拉伸实验机对其进行拉伸试验.本试验获得了这9种材料的大应变、大应力及杨氏模量.其结果可以为神经支架的选材、设计和制作提供力学参考依据.
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组织工程神经支架复合FK506修复周围神经长节段缺损以及痛觉变化的研究
[目的]探讨加入FK506制备的新型高仿生组织工程外周神经支架对SD大鼠坐骨神经缺损的修复及运动与感觉功能的恢复.[方法]将壳聚糖与Ⅰ型胶原蛋白加入不同浓度的FK506,通过改良冰冻干燥工艺制成新型高仿生神经支架,分组修复SD雄性大鼠坐骨神经10 mm缺损.术前及术后4、8、12周及16周,分别对大鼠后肢进行针刺、热刺激、旷场运动、坐骨神经指数及电生理指标测试.术后16周进行灌注取材观测再生外周神经大体形态、扫描电镜下观察神经再生数目、直径及髓鞘厚度.[结果]使用复合5 mg/ml FK506的组织工程神经支架修复组术后的大鼠后肢针刺(4.9±2.53)g、热刺激(6.53 ±2.47)s、旷场运动测试[总运动距离(3 798±435) cm、中央区活动距离(359±67) cm、平均速度(4.22 ±0.48) cm/s]、坐骨神经指数(-39.07±2.26)及电生理检测[CMAP潜伏期(1.26±0.13) ms、波幅(16.97±1.17)my、传导速度(26.04±2.49) m/s]与自体神经移植组相当,优于其他实验组.16周取材观察对比神经再生数目、直径及髓鞘厚度,低浓度复合支架组明显优于空白组及高浓度组,与自体神经移植组相当.[结论]壳聚糖与Ⅰ型胶原蛋白加5 mg/ml FK506制备的复合组织工程神经支架修复长节段神经缺损,受损神经痛、温觉功能和运动功能恢复良好,神经纤维再生明显,所支配的肢体功能恢复与自体神经移植相当.
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高仿真壳聚糖支架修复神经缺损的有效性研究
[目的]构建具有仿真结构的壳聚糖神经支架,评价其在体桥接大鼠15mm坐骨神经缺损的修复效果.[方法]应用自主研发的梯度冷冻干燥技术,制备具有仿真结构的壳聚糖神经支架.将该仿真支架修复大鼠15 mm坐骨神经缺损,应用形态计量学、逆行示踪、神经电生理以及行为学检测评价该仿真支架的修复效果.[结果]本实验构建的壳聚糖支架具有轴向平行排列的微管样超微结构,该结构高度仿真于正常神经基底膜结构.在修复大鼠15 mm坐骨神经缺损的实验中,该仿真支架可取得与自体神经移植相似的修复效果.[结论]高仿真壳聚糖神经支架具有与正常神经高度仿真的内部结构,在体修复效果好,有望成为自体神经移植的替代产品.
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皮质骨Ⅰ型胶原的提取及胶原-明胶支架材料的制备
[目的] 探索一种较理想的皮质骨Ⅰ型胶原的提取方法并制备胶原-明胶支架材料.[方法] 以牛皮质骨为原料,经低温液氮粉碎、梯度脱水、脱脂、脱钙处理成为脱钙骨基质粉.通过酶溶解法处理脱钙骨基质粉,经溶解、离心、透析、冻干等步骤获得皮质骨胶原,SDS-PAGE电泳、氨基酸分析等方法鉴定其特征;再以胶原、明胶通过冷冻干燥技术制备神经支架材料,扫描电镜观察其内部结构.[结果] 所得胶原经SDS-PAGE电泳、氨基酸分析等方法鉴定符合Ⅰ型胶原特征;制备的支架材料外观呈圆柱状,内部为孔径均匀平行排列的微管结构,具有仿生效果.[结论] 皮质骨中能够获得纯度较高的Ⅰ型胶原,可用于胶原材料的制作.
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大鼠脂肪干细胞与不同去细胞神经支架的体外相容性比较
目的:观察大鼠脂肪干细胞与2种不同去细胞神经支架的体外相容性,为周围神经组织工程寻求合适的种子细胞载体.方法:将大鼠脂肪干细胞与传统去细胞神经支架和改良法去细胞神经支架体外复合培养,采用倒置显微镜和扫描电镜观察细胞在2种支架上的生长、黏附情况,测定细胞活性及细胞吸附率,并与空白对照组比较.结果:脂肪干细胞可在2种去细胞神经支架上生长、黏附,在改良法去细胞神经支架上的细胞吸附率优于传统去细胞神经支架.结论:脂肪干细胞与2种去细胞神经支架均有较好的体外组织相容性,改良法去细胞神经支架可作为更有效的周围神经组织工程细胞载体.
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大鼠脂肪干细胞与去细胞神经支架相容性研究
目的 观察大鼠脂肪干细胞与去细胞神经支架体外相容性,为周围神经组织工程寻求合适的种子细胞载体.方法 将大鼠脂肪干细胞与去细胞神经支架体外体外复合培养,采用倒置显微镜和扫描电镜观察细胞在支架上的生长、黏附情况,MTT法测定细胞活性并与空白对照组比较.结果 脂肪干细胞在去细胞神经支架上生长、黏附情况良好.结论 两者具有很好的体外组织相容性,去细胞的神经支架可以作为有效的周围神经组织工程的细胞载体.
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二氧化硅纳米颗粒/胶原蛋白神经支架体外生物学特性研究
目的 探讨不同配比SiO2纳米颗粒/胶原蛋白复合材料作为神经支架的生物学特性.方法 2013年3月至2014年5月,采用冻干技术制作浓度分别为5、10、25、50、100和200 μg/ml SiO2纳米颗粒浓度的胶原蛋白神经支架,不含SiO2纳米颗粒的胶原支架作为本研究的对照组.动态光散射仪测量SiO2纳米颗粒的直径和大小,SEM观察纳米颗粒的形态.支架内接种培养许旺细胞(SCs),检测支架的细胞相容性,光镜下观察不同样本中SCs形态,MTT检测SCs在SiO2纳米颗粒/胶原复合支架的附着和增殖效果,荧光分光光度计测定支架内细胞经H33258染色后的DNA含量.上述实验数据经多重比较检验法后进行单向方差分析,P＜ 0.05为差异有统计学意义.结果 SiO2纳米颗粒呈球形,平均直径分布在150～190 nm,SCs在支架上培养了1d和3d后,所有培养的细胞中(除了100μg/ml支架中生长的细胞)都处于正常状态,其他样品的所有细胞中都呈纺锤形并伴随轴突延伸,细胞没有表现出明显的形态学差异.MTT细胞相容性检测显示,SCs的活性和增殖度先升高,后随着SiO2颗粒浓度的增加而降低,SCs的活性和增殖度在25 μg/ml中表现高,而当浓度大于50 μg/ml时明显降低,这与细胞形态变化的相符.DNA含量起初增加后随着浓度的增加而降低,25μg/ml时DNA含量多(P＜0.05),DNA含量与细胞形态变化相符.结论 25μg/ml的SiO2纳米颗粒/胶原蛋白支架有可能成为一种新的周围神经缺损修复材料.
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人源性同种异体去细胞外周神经材料标准制备方法的研究
目的 对目前文献报道使用的5种不同方法制备的人源性同种异体去细胞外周神经材料进行综合分析比较其优劣,以确定可供临床使用的标准的制备流程.方法 将人源性神经按5种不同方法进行化学萃取,制备的外周神经支架材料分别行苏木精-伊红(HE)染色、免疫组化(S-100、Col I)和透射电镜、氮含量测定等检测,观察5种方法去除许旺细胞、髓鞘和轴突等抗原成分以及基底膜保存完好的情况.结果 分别萃取2次持续24 h组神经的HE染色显示去除细胞和轴突彻底,纵切片上未见任何细胞,红染的神经内膜呈波浪状纵形排列,轴突、髓鞘结构消失而形成管柱状空隙;S-100染色呈阴性;Col I染色结果可以看出其结构呈松散不规则的棕黄色结构,而其它处理组则结构相对整齐的纵向带状结构.透射电镜显示该组与各处理之间髓鞘去除差异无统计学意义.氮含量测定显示该组蛋白含量比值低.结论 使用Triton X-100处理24 h再分别脱氧胆酸钠24 h持续萃取2次,可作为供临床使用的制备人源性去细胞同种异体神经支架材料的标准流程.
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去细胞神经支架联合VEGF修复周围神经缺损的实验研究
目的：观察去细胞神经支架联合血管内皮生长因子(VEGF)在促进周围神经损伤修复中的作用。方法购买雄性Wistar大鼠60只，先取15只成年Wistar大鼠作为神经供体，制备去细胞神经支架，将制备好的神经支架剪取长度约为1 cm的去细胞神经基膜管。根据实验要求，将余Wistar大鼠随机分为三组，每组大鼠均15只。实验组(A组)为去细胞神经支架移植+局部注射VEGF组；对照组Ⅰ(B组)为去细胞神经支架移植组；对照组Ⅱ(C组)为自体神经移植组。术后喂养1个月，并每日观察大鼠步态、患足溃疡恢复情况。术后1个月取移植段坐骨神经组织行HE染色、免疫组化染色观察再生神经S-100及轴突数量，髓鞘、神经纤维数等生长情况。结果术后1个月，三组大鼠的足部溃疡、步态均有不同程度的恢复，其中实验组恢复率接近于自体神经移植组，明显优于单纯去细胞神经支架移植组；A组的再生神经轴突数为(125.34±5.67)，B组再生神经轴突数为(62.32±3.71)，C组再生神经轴突数为(132.55±7.48)，A组与C组比较差异无统计学意义(P>0.05)，A组与B组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论去细胞神经支架联合VEGF在促进周围神经损伤修复过程中可能具有一定的作用。
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琼脂糖水凝胶神经支架的研究
目的:以琼脂糖水凝胶为材料,制备一种神经组织工程支架.方法:琼脂糖水凝胶溶于双蒸水中,利用自制的模具制备支架,冷冻干燥.经显微镜下观察测量其孔隙大小等指标.测试0.01mol·L-1磷酸盐缓冲液(PBS)中10天的体外降解率,并埋入SD大鼠皮下看其与周围组织反应.结果:制备出的支架具有半透性外壳及高孔隙率的内部海绵状结构,其微孔直径为40～125 μm,体外降解率为5.17%,与周围组织基本无毒性反应.结论:琼脂糖水凝胶作为神经组织支架材料,具有一定的应用潜力.
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不同去细胞神经支架制备方法的对比研究
目的 比较不同化学方法制备去细胞神经支架的效果,提供有效的组织工程神经支架.方法 2月龄雄性SD大鼠15只,体重200～250g,取双侧坐骨神经,随机分为3组,每组10条.根据处理方法不同,A组为正常未处理组;B组为传统Sondell法化学处理组;C组为采用Triton X-200、SB-10、SB-16处理的改良法组.制备后行HE染色、免疫组织化学染色及扫描电镜观察,并对去细胞程度、脱髓鞘程度及神经纤维管道完整性进行量化评价.结果 HE染色:A组神经纤维横断面呈圆形,胞核呈深蓝色,髓鞘呈网格状结构;B组轴突及细胞核均消失,神经内膜结构破坏明显;C组轴突及细胞核均消失,神经内膜形成不规则圆形空腔.层粘连蛋白免疫组织化学染色:A组基底膜围绕在髓鞘外周,中间有蓝染SC核;B组SC核及髓鞘结构消失,神经基底膜结构不完整;C组SC核及髓鞘结构消失,神经基底膜形成不规则圆形空腔.S-100蛋白免疫组织化学染色:A组SC及髓鞘呈棕褐色;B组及C组未见明显髓鞘染色.扫描电镜观察:A组髓鞘、轴突等内容物形态清晰;B组髓鞘、轴突等结构均消失,基膜管壁排列欠规则;C组基膜管壁胶原纤维排列有序.去细胞程度及髓鞘染色深度评分:B、C组均优于A组(P<0.05),其中髓鞘染色深度评分C组均优于B组(P<0.05);神经纤维管道完整性评分:C组优于B组(P<0.05),与A组相似(P>0.05);综合评价去细胞处理方法以C组方法为佳.结论 改良法所获得的去细胞神经的去细胞效果与传统Sondell法相似,而脱髓鞘及组织结构保留的效果优于后者,可作为一种新的神经支架材料.
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组织工程移植物对周围神经修复再生的研究进展
周围神经损伤是创伤骨科中常见的多发病之一，多见于四肢部位，主要由于周围神经受到牵拉、挤压、锐器切割及物理化学反应，致使神经结构或功能受损，从而导致患肢感觉及运动功能障碍及缺失[1]。目前，自体神经移植被认为是治疗外周神经损伤的金标准。但是长节段（>30mm）神经缺损，一直是医学界亟待解决的难题之一。研究表明[2]，虽然周围神经具有一定的再生的能力，但由于这种再生能力的效能较低，容易被周围的疤痕阻挡，使再生轴突分散而形成神经瘤，阻止神经修复。近年来组织工程的发展，目前神经支架、种子细胞以及生长因子在周围神经损伤修复治疗中起着巨大作用。组织工程移植物一般由三部分构成院神经支架、种子细胞和生长因子，其中神经支架作为种子细胞和生长因子的载体，是组成神经损伤修复微环境的主要结构。与其他的组织工程材料一样，组织工程神经移植物将神经支架、种子细胞、神经生长因子结合起来，作为构成神经再生微环境的重要成分，将功能性种子细胞植入神经支架中修复神经缺损往往能达到类似于自体神经移植的良好修复效果。
