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碳酸酐酶Ⅲ自身抗体在1型糖尿病人中的测定
目的 探讨1型糖尿病(T1D)患者血清抗碳酸酐酶Ⅲ自身抗体水平的变化及其与抗氧化物、细胞因子之间的关系.方法 选取T1D患者共368例(T1D组),另选取性别年龄匹配的健康受试者为对照组,测定其血清抗碳酸酐酶Ⅲ自身抗体、红细胞沉降率、超氧化物歧化酶(SOD)等4种抗氧化物和白细胞介素(IL)-2等4种细胞因子的水平.结果 T1D患者血清抗碳酸酐酶Ⅲ自身抗体水平显著高于健康对照组(P＜0.05);T1D患者的SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和丙二醛(MDA)水平显著低于健康对照组(P＜0.05);T1D患者的IL-2、IL-3和干扰素(IFN)-γ显著高于健康对照组(P＜0.05).结论 抗氧化物和细胞因子水平的变化可能参与了T1D患者碳酸酐酶Ⅲ抗体的产生.
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慢性阻塞性肺疾病患者股四头肌碳酸酐酶Ⅲ蛋白及其mRNA表达
目的 观察慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者骨骼肌碳酸酐酶Ⅲ(CAⅢ)蛋白及mRNA表达水平.方法 收集骨科手术诊疗患者的股四头肌标本,对照组11例,COPD者26例;根据患者BMI、去脂肪指数,COPD者分为COPD骨骼肌萎缩组(12例)和COPD骨骼肌非萎缩组(14例).Western blot检测3组受试者股四头肌CAⅢ蛋白表达,荧光定量PCR检测CAⅢmRNA表达水平.结果 (1)CAⅢ蛋白相对表达量对照组为1.000±0.062; COPD骨骼肌非萎缩组为1.110 ±0.014,高于对照组(P=0.0006);COPD骨骼肌萎缩组为1.260±0.068,高于COPD骨骼肌非萎缩组、对照组(P值均=0.000 1);3组比较差异有统计学意义(F=10.6,P＜0.05).(2)CAⅢmRNA相对表达量对照组为1.000 ±0.115;COPD骨骼肌非萎缩组为2.170±0.412;COPD骨骼肌萎缩组为3.770±0.788,高于COPD骨骼肌非萎缩组、对照组(P值均=0.000 1);3组比较差异有统计学意义(F=8.98,P＜0.05).(3)COPD骨骼肌萎缩组、COPD骨骼肌非萎缩组CAⅢ蛋白相对表达量与CAⅢmRNA相对表达量有相关性(r=0.620 8,P=0.003 4;r=0.569 0,P=0.005 4).结论 COPD者下肢骨骼肌存在CAⅢ蛋白、CAⅢmRNA表达升高,其升高的内在机制值得深入探讨.
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重症肌无力患者骨骼肌中减少的25000蛋白即为碳酸酐酶Ⅲ的论证
目的论证重症肌无力(MG)患者骨骼肌中特异性减少的25000蛋白为碳酸酐酶Ⅲ(CAⅢ)分子.方法用双向电泳结合免疫Western blot分析25000蛋白抗体和CAⅢ抗体有免疫反应的蛋白质分子的物化特征,分别用免疫Dot blot与免疫Western blot观察两种抗体对纯化的25000蛋白及骨骼肌蛋白匀浆的竞争结合,用免疫Western blot分析健康人与MG患者骨骼肌CAⅢ的蛋白表达.结果双向电泳结合免疫Western blot显示,25000蛋白抗体和CAⅢ抗体识别的蛋白质具有相同的相对分子质量和等电点;免疫Dot blot与免疫Western blot的竞争结合证实25000蛋白与CAⅢ为同一物质;免疫Western blot表明,用25000蛋白抗体与CAⅢ抗体检测健康人与MG患者骨骼肌25000蛋白表达的结果亦几乎是相同的.结论 MG患者骨骼肌特异减少的25000蛋白分子就是CAⅢ,这为进一步深入研究CAⅢ与MG的发病奠定了基础.
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去神经对大鼠骨骼肌碳酸酐酶Ⅲ表达和磷酸酶活性的影响
目的 观察去神经对骨骼肌碳酸酐酶Ⅲ(carbonic anhydrase Ⅲ,CAⅢ)表达及其磷酸酶(phosphatase)活性的影响,探讨神经冲动受阻是否为重症肌无力(myasthenia gravis,MG)骨骼肌CAⅢ减少的原因.方法 定向切断支配大鼠趾长伸肌(extensor digitorum longus,EDL)和比目鱼肌(soleus,Sol)的神经纤维,术后第7、14、28和56天用Western blot分析EDL和Sol的CAⅢ水平,用固相膜上原位酶活性染色方法评估CAⅢ的磷酸酶活性.结果 (1)正常侧(即去神经对侧)Sol的CAⅢ水平远高于EDL,并且两者都表现出随时间增加(动物年龄增长)而增加的趋势.去神经后,EDL的CAⅢ水平随时间的延长而逐渐增加;Sol的CAⅢ水平则以14 d为分界先增加后降低.(2)正常侧Sol的CAⅢ的磷酸酶活性[随时间增加(动物年龄增长)呈逐渐增加的趋势]均高于EDL(变化不明显).去神经后,Sol的CAⅢ磷酸酶活性(第14、28、56天分别为14.39±1.93、11.48±1.46、9.04±1.46)明显低于正常侧(22.75±1.80、25.26±3.15、25.82±2.97,t=0.002、0.005、0.002,均P＜0.05),EDL的CAⅢ磷酸酶活性与正常侧相比亦是降低,但差异无统计学意义.(3)正常侧EDL和Sol的CAⅢ蛋白表达水平和CAⅢ的磷酸酶活性相一致;去神经后CAⅢ蛋白表达水平和CAⅢ的磷酸酶活性发生了背离,即CAⅢ蛋白表达水平增加,但其磷酸酶活性却降低.结论 去神经所致的神经冲动传递障碍与MG自身抗体所致的神经冲动传递障碍对骨骼肌CAⅢ表达水平的影响不同,MG骨骼肌CAⅢ表达水平减少并非是其自身抗体所致的神经冲动传递障碍造成.
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重症肌无力患者骨骼肌中碳酸酐酶Ⅲ蛋白减少的原因
目的 分析重症肌无力患者(MG)骨骼肌中碳酸酐酶Ⅲ(CAⅢ)蛋白和CAⅢ mRNA的表达,并与健康对照组进行比较,探讨MG骨骼肌CAⅢ蛋白缺乏的原因.方法 用Western blot分析17例MG患者与19名健康人骨骼肌CAⅢ蛋白的水平,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术分析CAⅢ mRNA的表达.结果 Western blot显示,MG患者骨骼肌CAⅢ蛋白谱带密度低于健康人骨骼肌;经半定量分析,健康人骨骼肌CAⅢ蛋白水平的相对值为1.70±0.29,MG骨骼肌为0.76±0.08,两者差异有统计学意义(P=0.006).RT-PCR半定量结果为:健康人骨骼肌CAⅢ mRNA表达的相对值为0.29±0.04,MG骨骼肌为0.15±0.02,两组间差异亦有统计学意义(P=0.005).分析同一标本CAⅢ蛋白与CAⅢ mRNA表达,约77%的MG患者骨骼肌中两者呈一致性减少.结论 MG骨骼肌CAⅢ蛋白降低的主要原因是其本身CAⅢ mRNA的表达降低所致,骨骼肌CAⅢ mRNA的表达降低与MG发病的关系还需进一步阐明.
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大强度跑台运动及低频电刺激对大鼠骨骼肌及血清CAⅢ表达的影响
目的:观察急性大强度跑台运动及低频电刺激后大鼠骨骼肌及血清CAⅢ表达的变化,探讨CAⅢ与骨骼肌疲劳之间的关系.方法:36只雄性SD大鼠随机分为对照组、运动组和刺激组.运动组参照Bedford方案进行一次大强度跑台运动,造成大鼠运动性疲劳;刺激组采用低频电刺激的方法诱发大鼠腓肠肌疲劳.Western blot检测大鼠骨骼肌及血清CAⅢ的表达水平.结果:(1)与对照组相比,运动组大鼠比目鱼肌CAⅢ的表达水平明显降低(P＜0.05),但趾长伸肌及血清CAⅢ的表达水平与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05).(2)随刺激时间的延长,大鼠腓肠肌的肌张力峰-峰(P-P)值逐渐降低,与刺激开始时相比,刺激10min即显著降低(P＜0.05);而疲劳指数(FI)则随刺激时间的延长逐渐增加,刺激40min时FI高达52.14%左右.(3)与对照组相比,刺激组大鼠腓肠肌CAⅢ的表达水平显著降低(P＜0.05),而比目鱼肌及趾长伸肌CAⅢ的表达水平虽均有下降,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论:急性大强度跑台运动及低频电刺激诱发疲劳后均可引起相应骨骼肌CAⅢ表达下调(前者表现为比目鱼肌,后者为腓肠肌),表明骨骼肌疲劳的发生可能与其CAⅢ表达下调有关.
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TAT-CAⅢ融合蛋白的表达、纯化及其跨膜转运功能鉴定
1h,间接免疫荧光法检测两者在细胞内的分布情况.结果及结论:成功地构建了含有及不含有TAT的CAⅢ质粒表达载体;转化大肠埃希菌BL21(DE3)后表达并纯化出相对分子量分别约32 000(CAⅢ)和35 000(TAT-CAⅢ)的融合蛋白,Westernblot和酶活性染色鉴定表明成功地获得了两种融合蛋白;间接免疫荧光染色显示,TAT-CAⅢ孵育组细胞内可见有较强的绿色荧光,而CAⅢ组细胞内则未见荧光,表明TAT可介导CAⅢ由胞外跨膜转导进入胞内.
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充血性心力衰竭患者血清抗碳酸酐酶Ⅱ和Ⅲ自身抗体检测的意义
目的：使用已建立的方法检测充血性心力衰竭（CHF）患者血清中的抗碳酸酐酶Ⅱ和Ⅲ自身抗体、抗氧化物及细胞因子水平，初步评价其临床意义。方法选取58例3个月～1年前曾发生心肌梗死的CHF患者和58名健康对照者，测定其血清抗碳酸酐酶Ⅱ和Ⅲ自身抗体、红细胞沉降率（ESR）、超氧化物歧化酶（SOD）等5种抗氧化物和白细胞介素2（IL-2）等5种细胞因子的水平。结果 CHF患者血清抗碳酸酐酶Ⅱ自身抗体和ESR水平显著高于对照组（P＜0．05），SOD、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、过氧化氢酶（CAT）和总抗氧化能力（TAC）显著低于对照组（P＜0．05），丙二醛（MDA）水平显著高于对照组（P＜0．05）。CHF患者血清的IL-2和白细胞介素17（IL-17）水平较对照组显著升高（P＜0．05），白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和γ干扰素（IFN-γ）与对照组差异无统计学意义（P＞0．05）。结论 CHF患者可能存在自身免疫的现象，IL-2、IL-17和抗氧化能力的检测可能作为判断抗碳酸酐酶Ⅱ抗体出现的指标。
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胸部肿瘤患者肋间肌碳酸酐酶Ⅲ及其mRNA表达的研究
背景与目的:有研究提示肿瘤可以上调其原发灶及转移灶中的碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CA)含量,但至目前为止尚不知肿瘤组织是否会影响其他非转移组织中CA的含量.本研究通过测定CAⅢ及其mRNA在胸部良性肿瘤、肺腺癌患者肋间肌中的表达,探讨CAⅢ在这些疾病状态下的表达调控情况.方法:对昆明医科大学第一附属医院胸外科行开胸肿瘤切除术的38例住院患者取肋间肌组织活检,根据术后肿瘤组织病理结果提示纵隔良性肿瘤10例、肺腺癌12例.肺腺癌组患者根据肿瘤转移情况分为淋巴结转移组(6例)和无淋巴结转移组(6例),根据分化程度分为低分化组(3例)、中分化组(6例)及高分化组(3例),此外,16例单纯胸外伤作为对照组.然后,利用ELISA法定量测定患者肋间肌CAⅢ的浓度,利用Real-time PCR法检测患者肋间肌的CAⅢmRNA表达水平,分析比较各组患者肋间肌中CAⅢ的浓度定量及其mRNA表达水平差异,探讨CAⅢ在肺腺癌等疾病状况下的表达调控情况.结果:CAⅢ的浓度定量结果方面,与其他2组比较,肺腺癌组患者肋间肌CAⅢ的浓度显著升高(P＜0.01),且淋巴结转移组高于无淋巴结转移组(P＜0.05),CAⅢ浓度在低、中、高分化肺腺癌各组患者肋间肌间的表达差异无统计学意义(P均＞0.05).在CAⅢmRNA相对表达量方面(2-△△Ct),与其他2组比较,肺腺癌组患者肋间肌CAⅢmRNA表达水平显著升高(P＜0.01),且淋巴结转移组高于无淋巴结转移组高(P＜0.01),但CAⅢmRNA水平在低、中、高分化肺腺癌各组患者肋间肌间差异无统计学意义(P均＞0.05).患者CAⅢ的浓度定量及其mRNA表达水平与患者的FEV1/Pred％(第一秒呼气容积占预计值百分比)呈正相关(P＜0.05),与患者的年龄、体质量指数、FEV1/FVC％、PaO2、PaCO2无显著相关性(P均＞0.05).在各组患者,其肋间肌CAⅢmRNA表达水平与CAⅢ浓度定量呈现一致性表现,即mRNA表达水平升高组,其蛋白浓度定量也升高;相反,mRNA表达水平降低组,其蛋白浓度定量也降低.结论:肺腺癌组患者肋间肌的CAⅢ的浓度定量及其mRNA水平表达均较其他2组高.由于肺腺癌肋间肌CAⅢ的mRNA表达水平与CAⅢ的浓度定量呈现一致性表现,其对CAⅢ的调控可能主要在上游DNA转录水平得到实现,使得其肋间肌CAⅢmRNA转录水平及蛋白表达异常,进而影响其肋间肌功能状态.
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重症肌无力骨骼肌减少的25 000蛋白分子鉴定
目的:解析重症肌无力(MG)骨骼肌特异减少的相对分子质量约25 000的蛋白分子结构.方法:用双向电泳分离纯化骨骼肌25 000蛋白,电喷射离子化质谱和Edman降解法分别测定其精确分子质量和N-端部分氨基酸序列,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱测定其肽指纹图谱,在上述基础上,用Immuno-Western blot分析骨骼肌蛋白与25 000蛋白抗体及碳酸酐酶Ⅲ(CAⅢ)抗体的结合.结果:质谱和N-端部分氨基酸序列的测定表明,电泳显示的表观相对分子质量为25 000的蛋白其精确分子质量为29 632.05,该蛋白的N-端氨基酸可能是酰基化的;肽指纹图谱解析和蛋白资料库查询结果,结合对25 000蛋白生化和生物学特征的了解,发现25 000蛋白与CAⅢ的分子是非常相似的.结论:MG骨骼肌特异减少的相对分子质量约25 000的蛋白分子很可能是已知的蛋白质CAⅢ,该活性物质与MG发病的关系值得进一步研究.
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骨骼肌碳酸酐酶Ⅲ具有磷酸酶活性
目的:探讨骨骼肌碳酸酐酶Ⅲ(CA Ⅲ)是否本身具有磷酸酶活性.方法:用双向电泳结合Western blot方法将分离的大鼠骨骼肌蛋白转移至硝酸纤维膜,利用镜像原理,识别与CAⅢ抗体发生免疫反应的抗原在双向电泳图谱中的确切位置.在此基础上,以同样的方法与原理,对在固相膜上的磷酸酶活性进行原位染色,观察CAⅢ是否磷酸酶活性染色呈阳性.此外,通过磷酸酶抑制剂实验及酶催化反应动力学实验,论证CAⅢ的磷酸酶活性染色特异性及CAⅢ具有磷酸酶的功能.结果:CA Ⅲ抗体反应显示,利用镜像原理能从复杂的双向电泳图谱中容易识别CA Ⅲ蛋白;磷酸酶活性染色表明,鉴定的CA Ⅲ具有磷酸酶活性.磷酸酶特异抑制剂实验表明,CA Ⅲ的磷酸酶活性染色具有特异性;酶催化反应动力学研究证实,CAⅢ蛋白具有确凿的磷酸酶功能.结论:骨骼肌的CAⅢ本身具有磷酸酶活性,说明CAⅢ参与了细胞的磷酸化--去磷酸化过程,提示重症肌无力(MG)患者骨骼肌收缩无力和易疲劳可能涉及了MG的非免疫机制.另外,本研究创建的双向电泳结合Western blot方法可被借鉴用于"功能蛋白质组学"的研究.
关键词： 镜像双向电泳图谱 Western blot 碳酸酐酶Ⅲ 磷酸酶 -
重症肌无力血清中碳酸酐酶Ⅲ及其抗体的检测
目的:检测重症肌无力(MG)患者血清中碳酸酐酶Ⅲ(CAⅢ)及其抗体水平,探讨MG骨骼肌减少的CAⅢ是否参与MG的免疫发病.方法:用Western blot检测18例MG患者、16例其他神经肌肉疾病(ONMD)患者和15名健康人血清中CAⅢ水平;用Western blot与酶联免疫吸附测定(ELISA)检测上述血清中抗CAⅢ的抗体水平.结果:Western blot显示,正常人、MG和ONMD患者血清中都存在CAⅢ,但该蛋白的谱带密度在3组人的血清中差异无统计学意义(P＞0.05);Western blot与ELISA表明,上述血清中不存在抗CAⅢ的抗体.结论:正常人、MG和ONMD患者血清中均存在CAⅢ蛋白,但不存在抗该蛋白的抗体,说明MG骨骼肌减少的CAⅢ蛋白可能没有直接参与MG的免疫发病.
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碳酸酐酶Ⅲ的生物学特性及与临床疾病的关系
碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CA)是一种含锌的金属蛋白酶家族,至少有11种CA同工酶、3种与CA相关的蛋白质和1种受体型蛋白酪氨酸磷酸酶.其中CAⅢ在细胞内的分布、分子的理化特性、生理功能都有不同于其他CA的特点,其功能主要是清除骨骼肌中的CO2,参与细胞内磷酸化、信号转导及调节能量代谢,但在临床中特别是在神经科疾病中的应用还没有足够的认识.
