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TAT-CAⅢ融合蛋白的表达、纯化及其跨膜转运功能鉴定
1h,间接免疫荧光法检测两者在细胞内的分布情况.结果及结论:成功地构建了含有及不含有TAT的CAⅢ质粒表达载体;转化大肠埃希菌BL21(DE3)后表达并纯化出相对分子量分别约32 000(CAⅢ)和35 000(TAT-CAⅢ)的融合蛋白,Westernblot和酶活性染色鉴定表明成功地获得了两种融合蛋白;间接免疫荧光染色显示,TAT-CAⅢ孵育组细胞内可见有较强的绿色荧光,而CAⅢ组细胞内则未见荧光,表明TAT可介导CAⅢ由胞外跨膜转导进入胞内.
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蛋白质转导域-激肽释放酶对缺糖、缺氧后再恢复的神经元的保护作用
目的:观察蛋白质转导域-激肽释放酶(PTD-kallikrein)对缺糖、缺氧(OGD)再复糖、复氧培养的神经元保护作用,探讨其可能的作用机制.方法:以化学交联法构建PTD-kallikrein,用缓激肽B2受体抑制剂和(或)PTD-kallikrein对OGD再复糖、复氧培养的大鼠神经元进行干预,分别用MTT法及TUNEL染色测定不同条件培养的神经元生存率和凋亡.结果:PTD-kallikrein可显著提高OGD再复糖、复氧条件下培养的神经元生存率(P＜0.05),并减少其凋亡(P＜0.05).B2受体抑制PTD-kallikrein对神经元的保护(P＜0.05).结论:PTD-kallikrein对OGD再复糖、复氧条件下培养的神经元有明显的保护作用,并且很可能是通过B2受体的介导而发挥其功效的.
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融合蛋白PTD-XIAP的原核表达、纯化及其血脑屏障穿透功能的初步鉴定
目的:原核表达、纯化PTD-XIAP融合蛋白,鉴定其血脑屏障的通透功能.方法:反转录大鼠脑组织RNA,用PCR法扩增编码XIAP蛋白BIR1-2、BIR3-RING及BIR-2的cDNA片断,重组入pTransVector表达质粒并转化大肠埃希菌BL21;以IPTG诱导表达,用NTA-Ni层析柱分离纯化,Western blot鉴定.PTD-BIR3-RING经腹腔注入小鼠体内,用免疫荧光法检测脑组织中的分布.结果:PTD-BIR3-RING得到表达,相对分子质量约30×103,与6×His单克隆抗体有特异性反应.注入小鼠体内后,脑组织中广泛分布有阳性细胞.结论:重组PTD-BIR3-RING具有良好的血脑屏障穿透功能.
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PTD-Calbindin D28K融合蛋白的表达、纯化及其穿膜功能的鉴定
目的构建融合蛋白PTD-Calbindin D28K(CaBP28)的表达质粒,并进行诱导表达、纯化,在体外初步鉴定其跨膜转运功能.方法提取大鼠脑组织总RNA,反转录后用聚合酶链反应(PCR)法扩增编码CaBP28的全长cDNA序列,重组入pET-32a及含有PTD的pTransVector表达载体中,测序鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3),构建重组体的表达菌株.IPTG诱导表达后,以NTA-Ni亲和层析柱进行分离纯化,SDS-PAGE以及Western blot鉴定.纯化的CaBP28及PTD-CaBP28用FITC标记,分别以一定的浓度孵育体外培养的cos7细胞,后荧光显微镜下观察两者在细胞中的分布情况,并用流式细胞仪(FCM)做定量分析.结果成功地构建了含有及不含有PTD的CaBP28表达载体,插入片断783 bp,表达产物相对分子质量分别约30 000、50 000,经Wetern blot鉴定,与抗CaBPD28K抗体均有特异性反应.孵育培养的cos7细胞后,CaBP28-FITC仅少量吸附于细胞膜表面,而PTD-CaBP28-FITC则分布于胞质内;FCM定量分析发现,细胞荧光强度随着目的蛋白的孵育浓度或孵育时间增加而增加,并且孵育时间为1 h时荧光达到强.结论重组PTD-CaBP28具有良好的细胞穿膜功能.
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PTD-kallikrein对大鼠MCAO模型缺血再灌注损伤的保护作用
目的:观察PTD-kallikrein对大鼠MCAO模型缺血再灌注损伤的保护作用,并探讨其可能的作用机制.方法:以化学交联法构建PTD-kallikrein,鉴定PTD-kallikrein对血脑屏障的通透性,并测定PTD肽段对原代神经元、星形胶质细胞及PC12细胞的毒性作用,制备大鼠MCAO模型,梗死90 min后再灌注,并分为生理盐水组、Kallikrein组、PTD-kallikrein组和PTD-kallikrein+B2抑制剂组.再灌注后24 h,分别用NSS量表测定神经功能,TTC染色测定梗死灶体积,ELISA测定梗死灶细胞因子IL-1β、TNF-α及PGE2的含量.结果:PTD-kallikrein能通过血脑屏障,1 μmol/L PTD肽段对上述3种细胞无毒性,10 μmol/L PTD肽段对原代神经元和PC12细胞有轻度毒性;PTD-kallikrein能显著改善脑缺血导致的神经功能障碍、减小梗死体积、抑制细胞因子IL-1β、TNF-α及PGE2的释放,B2受体抑制剂能明显抑制PTD-kallikrein的神经保护作用. 结论:PTD-kallikrein对大鼠MCAO模型缺血再灌注损伤有显著保护作用,并且很可能通过B2受体介导而发挥该功效.
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PTD-Lmp-3融合蛋白的纯化、表达和鉴定
目的 构建融合蛋白PTD-Lmp-3的表达质粒,并进行诱导表达、纯化及鉴定.方法 利用基因重组技术构建pET43.1a-PTD-Lmp-3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达融合蛋白,经Ni2+-NTA层析纯化,SDS-PAGE和Westcrn blot鉴定目的 蛋白.结果 成功构建了表达质粒pET43.1a-PTD-Lmp-3,表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析,经IPTG诱导表达的总菌体蛋白在融合蛋白的相应位置PTD-LMP-3约为22 kD,可溶性分析发现融合蛋白主要以上清形式存在,纯化后得到了目的蛋白.Western blot鉴定显示表达蛋白具有抗原性.结论 成功构建了PTD-Lmp-3的重组表达载体,使融合蛋白在大肠埃希菌BL21(DE3)中高败表达,亲和层析后获得了纯化目的蛋白,为进一步研究奠定了基础.
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蛋白质转导及在神经科学研究中的应用
蛋白质转导或蛋白质治疗是通过表达载体法或化学交联法将具有治疗作用的外源性蛋白质与称为蛋白质转导域的氨基酸片段相连,以非受体和非温度依赖的方式穿越细胞膜进入胞内达到治疗疾病的目的.这种内在化的异质蛋白质不仅依旧保持了原有的生物学活性和功能,而且能在保持血脑屏障完整的情况下进入脑内.目前,蛋白质转导技术除用于转导肿瘤特异抗体和药物进行抗肿瘤治疗以及制备抗感染或抗病毒的疫苗外,也已广泛应用于神经科学和与神经疾病相关的研究.
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PTD介导的蛋白转导技术及其在医学领域中的应用
生物活性的大分子物质导入细胞内部,能够直接有效地改变细胞的状态,因而具有巨大的潜在医药价值.但是一直以来,如何将具有生物活性的大分子物质导入细胞内部始终困扰着人们,蛋白质转导域(PTD)介导的蛋白转导技术解决了这一难题.其高效的转导功能为疾病的临床治疗、治疗性蛋白药物的开发、基础医学和应用医学等领域的研究开辟了一条崭新的途径.人们已经成功地应用这一技术将多种物质导入细胞或机体的组织器官,显示了其优越的应用价值.
