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TNF-α通过PKCα信号通路诱导人系膜细胞IP3R1表达
目的 探讨肿瘤坏死因子(TNF-α)对人肾小球系膜细胞(HMCs)Ⅰ型1,4,5-三磷酸肌醇受体(IP3R1)蛋白和mRNA表达的影响及其分子机制,以期为肝肾综合征(HRS)肾小球滤过率下降的发生机制和防治思路提供理论依据.方法 用实时定量PCR和免疫印迹法检测TNF-α刺激HMCs 0、2、4、8、24 h的IP3R1mRNA和蛋白表达的情况.以TNF-α刺激HMCs 8 h为对照,应用D609,U73122,PP1,Safingol和Rottlerin预处理HMCs后,实时定量PCR法检测TNF-α对IP3R1 mRNA表达的影响；以TNF-α刺激HMCs 24 h组为对照,免疫印迹法检测上述抑制剂预处理后,TNF-α对IP3R1蛋白表达的影响.此外,应用非放射性测活法检测0、4、8、24 h TNF-α对PKC-α的活化影响,并予D609、Safingo干预后,检测TNF-α对PKC-α的活化的影响.结果 TNF-α刺激HMCs 2 h到8 h IP3R1mRNA表达明显增加,于8h达高峰(P＜0.01),而于24 h有所下降(P＜0.01)；而IP3 R1蛋白表达于TNF-α刺激4h开始升高,至24 h IP3R1蛋白升高达高峰(P＜0.01).与8h组比较,抑制剂+TNF-α各组中,Safingol+ TNF-α组和D609+ TNF-α组IP3R1mRNA的表达明显下降,差异具有统计学意义(3.30±0.81) vs.(1.95±0.13),P＜0.05； (2.10±0.49),P＜0.01.与24 h相比,Safingol+ TNF-α组和D609+ TNF-α组,IP3R1蛋白的表达亦明显下降(3.09±0.13) vs.(1.86 +0.39),P＜0.01；(1.98±0.02),P＜0.01.非放射性测活检测显示TNF-α处理8h使PKC-α自动磷酸化而活化,而D609或Safingol预处理后,可抑制TNF-α对PKC-α的活化.结论 TNF-α能上调IP3R1 mRNA及蛋白的表达,PC-PLC/PKC-α信号途径可能在TNF-α上调IP3R1的表达中起重要作用.
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肿瘤坏死因子-α增强肝肾综合征时肾脏Ⅰ型1,4,5-三磷酸肌醇受体表达
目的: 通过观察TNF-α对肾组织中Ⅰ型IP3R表达的影响来探讨肝肾综合征的发病机制.方法: 制备大鼠离体肾灌注模型,随机分成对照组(A组)、肝素处理组(B组)、TNF-α处理组(C组),留取的标本应用免疫组织化学技术、Western blot及实时定量PCR检测肾组织Ⅰ型IP3R蛋白的定位、表达及mRNA的变化.结果: Ⅰ型IP3R主要分布于肾小球系膜细胞和血管平滑肌细胞的胞质内.免疫组化结果显示,C组与A组相比棕褐色颗粒着色的阳性细胞明显增多,有显著性差异(U=2.26,P＜0.05);B组与A组相比阳性染色细胞无明显减少(P＞0.05);Western blot结果与免疫组织化学结果相一致:C组与A组相比Ⅰ型IP3R蛋白表达水平明显增高,有显著性差异(1.89±0.11vs 0.55±0.03,P＜0.05);B组与A组相比无显著性差异(P＞0.05);实时定量PCR结果显示:C组与A组相比Ⅰ型IP3R mRNA的表达水平明显增高,有显著性差异(7.99±0.12 vs 1.00±0.05,P＜0.05);B组与A组相比无显著性差异(P＞0.05).结论: TNF-α可增强肾小球系膜细胞和血管平滑肌细胞Ⅰ型IP3R蛋白的表达,且Ⅰ型IP3R mRNA也呈增加趋势.
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TNFα通过TNFR1/PKCα和TNFR2信号通路诱导人肾小球系膜细胞IP3R1的表达
目的:探讨肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNFα)对人肾小球系膜细胞(human mesangial cells,HMCs)IP3R1蛋白和mRNA表达的影响及PKC和肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor,TNFR)在此信号通路中的作用,以期为肝肾综合征(hepatorenal syndrome,HRS)肾小球滤过率下降的发生机制和防治思路提供理论依据.方法:用实时定量PCR和免疫印记法检测IP3R1mRNA和蛋白表达的情况,并分别用PMA耗竭内源性蛋白激酶C(endogenous protein kinase C,PKC),PKCα特异性抑制剂Safingol和PKCδ特异性抑制剂Rottlerin及HA-DN-PKCα质粒转染干预上述诱导实验.同时,用免疫印记法检测TNFα对PKCα和p-PKCα的表达的影响.此外,免疫印记法检测TNFR对PKCα的活化及IP3R1蛋白表达的影响.结果:TNFα.作用HMCs后,IP3R1蛋白和mRNA表达均明显增加.PMA、PKCα抑制剂Safingol,HA-DN-PKCα质粒转染均能明显阻断TNFα诱导的IP3R1蛋白的上调,而PKCδ抑制剂Rottlerin无明显阻断作用.TNFα刺激HMCs,各不同时间组总PKCα蛋白表达无明显差异,而TNFα刺激8 h p-PKCα蛋白表达明显增加.TNFR1抗体+TNFα组和TNFR2抗体+TNFα组,IP3R1蛋白表达均有明显的不同程度的下降.TNFR1抗体+TNFα组p-PKCα蛋白表达明显下降,而TNFR2抗体+TNFα组,p-PKCα蛋白表达无明显变化.结论:TNFα能上调HMCs中IP3R1蛋白及IP3R1mRNA的表达.活化的PKCα可能在TNFα上调IP3R1的表达中起重要作用.TNFα可能通过TNFR1/PKCα途径及TNFR2途径上调IP3R1的表达.
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TNF-α增强主动脉平滑肌细胞内1型1,4,5-三磷酸肌醇受体表达参与感染性休克的发生机制
目的 研究TNF-α对主动脉平滑肌细胞(VSMC)内1型1,4,5-三磷酸肌醇受体(IP3RⅠ)表达的影响,揭示TNF-α影响VSMC收缩功能参与感染性休克的发生机制.方法 原代分离培养大鼠VSMC.按TNF-α处理的不同时间点(0、4、8、24h)分4组.分别应用Western blot、免疫荧光、RT-PCR、双荧光素酶检测方法,观察TNF-α对IP3R Ⅰ mRNA、蛋白表达及其启动子活性的影响.结果 TNF-α处理组细胞内IP3RⅠ分布未见变化,8、24h组荧光强度增强提示IP3RⅠ蛋白含量增加,IP3RⅠ蛋白表达升高(4h:1.059±0.005 vs 1.000 ±0.002,P =0.010;8h:2.416 ±0.042 vs 1.000±0.002,P ＜0.01;24h:2.138±0.010vs 1.000 ±0.002,P ＜0.01,n=9),IP3R Ⅰ mRNA表达明显增加(4h:2.260±0.889 vs 1.00±0.02,P=0.193；8h:5.449±2.279vs1.00±0.02,P=0.000；24h:3.049±1.684 vs 1.00±0.02,P=0.042,n=9).转染PGL3-IP3R Ⅰ promoter质粒后TNF-α组IP3R Ⅰ启动子活性明显增强(3.56±0.65 vs 1.00±0.05,P=0.020,n =9).结论 TNF-α可上调IP3R Ⅰ基因启动子活性,从而引起IP3R Ⅰ蛋白表达升高,增强VSMC内IP3Rs系统介导的Ca2+释放作用,这可能是TNF-α影响VSMC收缩功能参与感染性休克血管调控的机制之一.
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肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞1,4,5-三磷酸肌醇受体表达的变化
目的:检测肺动脉高压(PAH)大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)上1,4,5-三磷酸肌醇受体(IP3R)的亚型及IP3R各亚型在PAH时表达水平的变化.方法:采用大鼠一次性腹腔注射野百合碱(MCT)60 mg/kg复制PAH动物模型,用Western blot法检测IP3R亚型的表达及在PAH状态下其蛋白水平表达的变化.结果:大鼠PASMCs共同表达3个IP3R亚型,在PAH时IP3R1表达水平明显增高,约为对照组的2倍(P<0.01),而IP3R2和IP3R3的表达水平无明显变化.结论:PASMCs的IP3R1表达增强可能参与了PAH的发生.
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肿瘤坏死因子α增强主动脉环收缩在感染性休克中的机制研究
目的：探讨肿瘤坏死因子α（TNF-α）对去内皮主动脉环反应性及主动脉血管平滑肌细胞（VSMC）内游离钙离子浓度（[Ca2＋]i）的影响，以证明TNF-α通过1，4，5-三磷酸肌醇受体（IP3Rs）增强VSMC对缩血管物质反应性是感染性休克早期维持血压稳定的重要机制。方法选取雄性Wistar大鼠24只制备离体去内皮主动脉环，随机分为去内皮对照组、去内皮TNF-α组、去内皮无钙对照组和去内皮无钙TNF-α组，各6只，给予血管紧张素Ⅱ（ AngⅡ）刺激观察主动脉环收缩幅度。另选取3只Wistar大鼠分离鉴定原代VSMC，分为对照组和TNF-α组；另设上述2组于加AngⅡ前10 min加入IP3Rs阻断剂2-氨基乙氧基联苯硼酸盐（2-APB），即2-APB拮抗对照组和2-APB拮抗TNF-α组，观察在AngⅡ刺激后VSMC内[ Ca2＋] i的变化及阻断情况。结果有钙条件下，去内皮TNF-α组给予AngⅡ后主动脉环的收缩幅度高于去内皮对照组（ P＜0.05）；无钙条件下，去内皮无钙TNF-α组给予AngⅡ后主动脉环的收缩幅度亦高于去内皮无钙对照组（P＜0.05）。 AngⅡ刺激可使VSMC内[Ca2＋]i在短时间内迅速增加， TNF-α组[ Ca2＋] i升高值高于对照组、2-APB拮抗对照组和2-APB拮抗TNF-α组〔（1315.1±496.4）与（411.6±80.3）、（13.1±9.8）、（18.7±11.9）， P＜0.05〕；而2-APB拮抗对照组、2-APB拮抗TNF-α组对AngⅡ刺激均失去反应，两组VSMC内[Ca2＋]i间无差异（P＞0.05）。结论 TNF-α可增加AngⅡ刺激VSMC引起的[Ca2＋]i上升，进而引起去内皮主动脉环对AngⅡ反应性增强；证明TNF-α是通过IP3 Rs通路产生效应的，这可能是感染性休克早期机体维持血压稳定的机制之一。
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羟基红花黄色素A的血管作用及其机制研究
目的 探讨羟基红花黄色素A(HSYA)对离体大鼠胸主动脉环收缩功能的影响及其机制.方法 采用生物信号采集系统记录灌流大鼠胸主动脉环张力变化,观察HSYA(1×10-6～1×10-4 mol/L)对苯肾上腺素(PE)(1×10-6～1×10-4 mol/L)、KCl(6×10-2 mol/L)和CaCl2(1×10-5～3×10-3 mol/L)收缩血管功能的影响,并观察钌红(RR)或肝素(HP)预处理对HSYA作用的影响.结果 HSYA抑制KCl、PE对完整内皮和去内皮血管环的收缩作用,且呈浓度依赖性.HSYA可使CaCl2量-效曲线下移,呈浓度依赖性.HSYA+HP抑制血管收缩的作用比单用HSYA明显(P<0.05),与HP相比差异无统计学意义(P>0.05);HSYA+RR抑制血管收缩的作用与单用RR或HSYA比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 HSYA的血管作用可能是通过抑制Ca2+内流和减小Ca2+浓度实现的.
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肿瘤坏死因子-α抗体对梗阻性黄疸大鼠肾脏IP3R表达的影响
目的 研究肿瘤坏死因子-α(TNF-α)单克隆抗体对梗阻性黄疸大鼠肾功能的影响及机制.方法 将60只雄性SD大鼠随机分成假手术组、模型组、干预组,采用胆总管结扎(CBDL)造梗黄模型,干预组于结扎后第2周开始腹腔注射TNF-α单克隆抗体[0.1 mg/(kg·2d)].并于干预后1、2、3、4周麻醉动物,假手术组与5周模型组动物同批麻醉,留取肝和肾组织.采用HE染色确定模型建立情况,通过Western blot方法检测1,4,5-三磷酸肌醇受体(IP3R)的含量,免疫组织化学方法检测IP3R在肾组织的表达.结果 HE染色显示模型组和干预组肾间质有炎性细胞浸润,干预组较轻.免疫组化和Western blot显示模型组肾组织IP3R蛋白表达较多,干预组略下降,但均明显高于假手术组(P＜0.05).结论 梗阻性黄疸时肾小球前小动脉平滑肌细胞内的IP3R蛋白的表达增强,而TNF-α单克隆抗体干预治疗可减轻IP3R表达增强的程度,部分减轻肾功能损害的发生.
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替米沙坦对糖尿病肾病大鼠肾组织Ⅰ型1,4,5-三磷酸肌醇受体表达的影响
目的:探讨替米沙坦对糖尿病肾病(DN)大鼠肾组织I型1,4,5-三磷酸肌醇受体(IP3R)蛋白及mRNA表达的影响.方法:50只SD大鼠分为5组,即正常对照组(NC组)、DN 6周组(D6组)、DNl2周组(D12组)、替米沙坦治疗6周组(T6组)和替米沙坦治疗12周组(T12组),各组10只.D6、T6、D12和T12组大鼠制作DN动物模型,造模成功后T6和T12组分别给予替米沙坦治疗6和12周.采用免疫组织化学SP法检测各组大鼠肾组织I型I P3R蛋白的表达,RT-PCR测定其mRNA的表达.结果:5组大鼠.肾组织I型IP3R蛋白和mRNA表达的比较.差异有统计学意义(F=42.321和59.482,P均<0.001);T6、D6、T12和D12组较NC升高,T6组较D6组下降,T12组较D12组下降(P均<0.05).结论:替米沙坦可能通过降低I型IP3R的表达治疗DN.
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糖尿病肾病大鼠肾脏组织中I型1,4,5-三磷酸肌醇受体的表达
目的:检测糖尿病肾病(DN)大鼠肾脏组织中I型1,4,5-三磷酸肌醇受体(IP3R)的表达.方法:35只健康雄性清洁级SD大鼠随机分成正常对照组(NC组,n=10)和DN组(以新鲜配制的枸橼酸缓冲液稀释链脲佐菌素成10 g/L的溶液,按60 mg/kg腹腔注射进行造模,当血糖值超过16.7 mmol/L,表明糖尿病模型成功.普通饮食继续喂养3周、6周、12周.用放射免疫法测定24 h尿蛋白排泄量,≥30 mg时确认DN大鼠模型成功),后将DN大鼠随机分为DN 3周组(n=9)、DN 6周组(n=8)和DN 12周组(n=8).应用免疫组织化学法、RT-PCR测定4组大鼠肾脏组织中I型IP3R蛋白及mRNA的表达.结果:I型IP3R蛋白主要分布于肾小球系膜区、毛细血管袢和血管平滑肌细胞内,而肾小管未见阳性染色.与NC组相比,各DN组I型IP3R蛋白阳性细胞率和mRNA的表达明显增高,差异有统计学意义(F=41.536、53.635,P<0.001).结论:肾脏组织中IP3R表达增强可能是导致DN产生的重要因素之一.
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PKCα在人系膜细胞IP3R1蛋白表达中的调控作用
目的 探讨肿瘤坏死因子α(TNFα)对人肾小球系膜细胞(HMCs) IP3R1蛋白和mRNA表达的影响及PKC在此信号通路中的作用,以期为肝肾综合征(HRS)肾小球滤过虑下降的发生机制和防治思路提供理论依据.方法 用实时定量PCR和免疫印记法检测IP3R1 mRNA和蛋白表达的情况,并分别用PMA耗竭内源性蛋白激酶C(PKC),PKCα特异性抑制剂Safingol和PKCδ特异性抑制剂Rottlerin及HA-DN-PKCα质粒转染干预上述诱导实验.同时,用免疫印记法检测TNFα对PKCα和p-PKCα表达的影响.用非放射性测活检测TNFα对PKCα的活化及抑制剂对PKCα活化的影响.结果 TNFα作用HMCs后,IP3R1蛋白和mRNA表达均明显增加.PMA,PKCα抑制剂Safingol,HA-DN-PKCα质粒转染均能明显阻断TNFα诱导的IP3R1蛋白的上调,而PKCδ抑制剂Rottlerin无明显阻断作用.TNFα刺激HMCs,各不同时间组总PKCα蛋白表达无明显差异,而TNFα刺激8h p-PKCα蛋白表达明增加.此外,非放射性测活表明TNFα活化PKCα,Safingol可阻断PKCα的活化.结论 TNFα能上调HMCs中IP3R1蛋白及IP3R1mRNA的表达.活化的PKCα在TNFα上调IP3R1的表达中起重要作用.
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肿瘤坏死因子-α增强内皮素肾血管收缩作用的研究
目的探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)及肝素对内皮素-1(ET-1)收缩肾脏血管作用的影响,研究TNF-α在肝肾综合征发病机制中的作用.方法应用离体灌注肾技术,恒量灌流正常大鼠的离体肾脏,在多导生理记录仪上连续记录肾脏灌注压力的改变,观察经TNF-α、肝素灌流90 min后,在ET-1刺激下,肾脏灌注压的改变.结果对照组,应用2 nmol/L ET-1刺激,可使灌注压上升(47±9)mm Hg;TNF-α(1μg/L)处理组,基线压力无改变,应用2 nmol/L ET-1刺激,可使灌注压上升(97±36)mm Hg,与对照组比较差异有非常显著性,t=3.811,P＜0.01;肝素(10 mg/L)处理组,基线压力无改变,应用2 nmol/L ET-1刺激,可使灌注压上升(11±6)mm Hg,与无肝素预灌流组[高出基础灌注压(30±6)mm Hg)]比较其灌注压升高幅度明显下降(t=9.41 4,P＜0.01).肾组织HE染色,3组均未见病理改变.结论 TN F-α可能是通过增强三磷酸肌醇受体表达促进肾血管收缩,在肝肾综合征的发病机制中发挥重要作用.
