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抗人卵巢癌×抗人CD3双特异单链抗体介导的效应细胞在体外对卵巢癌细胞的杀伤作用
目的研究双特异单链抗体(scBsAb)介导的Jurkat细胞(CD3+)及人外周血单个核细胞(PBMC)在体外对人卵巢癌细胞株SKOV3细胞的杀伤活性,从而探讨其用于卵巢癌治疗的可能性. 方法以抗人卵巢癌×抗人CD3 scBsAb激活效应细胞,以SKOV3为靶细胞,用MTT法测定不同实验条件下的杀伤活性. 结果 (1) 以重组白细胞介素2(rIL-2)、抗CD3单克隆抗体、抗CD28重链单域抗体(VH)预刺激Jurkat及PBMC细胞比单纯用scBsAb激活效应细胞杀伤活性高;(2) 以Jurkat细胞或PBMC细胞作为杀伤细胞可得到相似的杀伤活性,高杀伤率均在75%左右;(3) 杀伤活性与scBsAb的浓度、作用时间及效靶比有关.对于Jurkat细胞,在抗体终浓度为21μg/ml,反应时间为48h,效靶比为10∶1时达到大杀伤率74.8%;对于PBMC细胞,在抗体浓度为20μg/ml,反应时间为72h,效靶比为1∶1时达到大杀伤率73.1%.(4) 多因子联合应用能有效提高杀伤活性. 结论 scBsAb在体外能够有效介导效应细胞杀伤肿瘤细胞,有明显的抗癌作用,具有潜在的应用前景.
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抗CD3抗CEA抗体诱导杀伤细胞对胃癌体内杀伤的作用
目的 探讨抗CD3抗CEA双特异性单链抗体诱导杀伤细胞(CIK细胞)在体内杀伤胃癌的作用.方法 将BGC823细胞种植裸鼠后,建立裸鼠胃癌模型,分为3组,分别经尾静脉注入生理盐水、CIK细胞和CIK细胞+双特异性单抗,每3天治疗1次,共6次,取出肿瘤组织称重,并计算出各组的抑瘤率.结果 在体内,CIK组和CIK+双特异性单抗组均可抑制肿瘤生长,抑瘤率分别为27.4％和41.7％,与对照组比较,差异均有统计学意义(均P＜0.05).CIK组与CIK+双特异性单抗组的瘤体积、瘤重、抑瘤率比较,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 CIK细胞本身可以抑制肿瘤细胞的生长,在加入抗CD3抗CEA双特异性单链抗体后,抑瘤作用明显增强.
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抗EGFR/抗KDR双特异性单链抗体的构建及表达
针对EGFR或VEGFR信号通路的相互作用导致的耐药性,为增强抗EGFR或抗VEGFR2抗体单独使用疗效不住的癌症的治疗效果,本文利用重叠PCR将抗人EGFR胞外区单链抗体基因scFv-E 10和抗人VEGFR2(KDR)的单链抗体基因scFv-AK404R融合在一起,得到抗EGFR/抗KDR双特异性单链抗体(bispecific singlechain diabody,scDb)基因,scDb的连接肽序列为15个氨基酸(G4S)3,在肽链的C端引入His标签及myc标签.将scDb基因连接入载体pHEN2,转化大肠杆菌HB2151并诱导表达,经镍柱纯化获得电泳纯scDb蛋白,产量约为570 μg·L-1发酵液.ELISA测定显示,scDb与EGFR胞外区的结合与亲本scFv-E10相当,与KDR胞外区的结合略低于亲本scFv-AK404R,表明抗EGFR/抗KDR scDb可与EGFR和KDR两种抗原特异性结合,可用于进一步的抗肿瘤活性研究.
关键词： 表皮生长因子受体 血管内皮生长因子受体2 双特异性单链抗体 单链抗体 原核表达 -
双特异性单抗对胃肠癌的体内杀伤作用
目的 探讨抗CD3抗CEA双特异性单链抗体介导CIK细胞在体内杀伤胃肠癌的作用.方法 分别将人胃低分化腺癌BGC823细胞和人结肠中分化腺癌SW1116细胞种植裸鼠后,建立裸鼠胃癌及肠癌模型,分为3组分别经尾静脉注入生理盐水、CIK细胞及CIK细胞+双特异性单抗,每3天治疗1次,共6次,取出肿瘤组织称重,并计算出各组的抑瘤率.结果 在体内,CIK组和CIK+双抗组均可抑制肿瘤生长,对胃癌的抑瘤率分别为29.90％和44.33％.对结肠癌的抑瘤率分别为14.93％和38.81％.CIK+双抗组:胃癌及结肠癌的瘤体积、瘤重明显小于CIK组.结论 CIK细胞本身可以抑制肿瘤细胞的生长,在加入抗CD3抗CEA双特异性单链抗体后抑瘤作用明显增强.
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抗PSA/抗CD3两种双特异性单链抗体的活性研究
目的:研究并比较已成功构建的抗PSA/抗CD3两种双特异性单链抗体的生物学活性.方法:利用流式细胞仪和51Cr释放试验评价抗PSA/抗CD3双特异性单链抗体的抗原亲和活性和体外介导杀伤靶细胞的效果.建立前列腺癌裸鼠模型,分为非治疗组、对照组、双特异性单链抗体(BsAb)组和多价双特异性单链抗体(mBsAb)组,分析两种双特异性单链抗体在体内介导细胞毒T细胞对肿瘤细胞杀伤的能力.结果:流式细胞仪结果显示:BsAb与LNCaP细胞和Jurkat细胞的阳性结合率分别为56.3%和55.4%;mBsAb与LNCaP细胞和Jurkat细胞的阳性结合率分别为74.0%和83.0%.在体外,有细胞毒T细胞存在时两种抗体均可引起前列腺癌细胞的裂解,裂解效率分别与抗体浓度和T细胞与靶细胞比例呈止相关.与对照组比较,接种前列腺癌细胞的裸鼠在体内注射激活的细胞毒T细胞的同时分别接受两种抗体的治疗后,肿瘤生长均明显受到抑制(P＜0.05).在亲和力、体外杀伤和体内抑制肿瘤生长等方面,mBsAb的活性明显优于BsAb.结论:抗PSA/抗人CD3 BsAb及其四聚体均具有良好的生物学活性,单链抗体四聚体的形成可以明显改善抗体的生物学活性.
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双特异性单链抗体介导的CIK细胞对结肠癌的体内杀伤作用
目的 观察双特异性单链抗体介导的细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)细胞在体内杀伤结肠癌细胞的作用.方法 将SW1116细胞种植裸鼠后,建立裸鼠结肠癌模型,分为3组分别经尾静脉注入生理盐水、CIK细胞及CIK细胞+双特异性抗体,每周治疗1次,共4周,取出肿瘤组织称重,并计算出各组的抑瘤率.结果 在体内,CIK组和CIK+双抗组均可抑制肿瘤生长,抑瘤率分别为29.70%和65.02%,与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).CIK组和CIK+双抗组的瘤体积、瘤重、抑瘤率比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 CIK细胞本身可以抑制肿瘤细胞的生长,在加入抗CD3抗癌胚抗原(CEA)双特异性单链抗体后抑瘤作用明显增强.
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抗前列腺特异抗原/抗CD3双特异性单链抗体四聚体的制备
本实验旨在构建人IgG3上游铰链区/p53四价功能域融合基因和抗前列腺特异抗原/抗CD3双特异性单链抗体的基础之上[1],进一步制备该双特异性单链抗体的四聚体.
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抗人VEGFR2与抗人EGFR的双特异性重组蛋白治疗结直肠癌的体内外研究
目的 构建一种可以同时靶向抑制VEGFR2和EGFR分子的双特异性单链抗体,从而降低单一通路抑制而造成的耐药性,增强抗肿瘤效果.方法 通过Overlap PCR的方法通过柔性肽G4S将雷莫芦单抗的可变区与西妥昔单抗连接,构建入工程载体,并通过毕赤酵母表达体系进行表达纯化,获得同时靶向VEGFR2和EGFR的双特异性单链抗体(scDb),命名为VE-scDb;流式细胞术检测双特异性单链抗体对EGFR和VEGFR2过表达的结直肠癌细胞系HT-29的结合能力;将单链抗体与碱性荧光染料罗丹明B偶联,使用激光共聚焦检测单链抗体在体外对HT-29细胞的靶向能力;建立HT-29荷瘤小鼠动物模型,检测双特异性单链抗体的体内抗肿瘤活性.结果 通过基因工程手段和毕赤酵母表达及镍柱纯化,成功获得双特异性单链抗体VE-scDb,经Western blot鉴定验证了 VE-scDb表达及装配正确.流式细胞术检测VE-scDb与结直肠癌细胞HT-29的结合率为50.1％,与亲本雷莫芦单抗(55.0％)与西妥昔单抗结合率(53.2％)相当.体外靶向性实验验证VE-scDb可以在体外很好的靶向结直肠癌细胞系HT-29,VE-scDb组的细胞平均荧光强度为97.24±6.72,明显优于阻断对照组(26.29±3.02)(P＜0.01).通过裸鼠移植瘤模型的体内抗肿瘤检验,VE-scDb组在体内仍能发挥较强的抗肿瘤效果,高剂量组肿瘤抑制率可以达到(73.70±6.16)％,明显优于亲本雷莫芦单抗(44.80±5.91)％和西妥昔单抗组(37.75±14.04)％(P＜0.01).结论 本文采用毕赤酵母表达体系成功构建并表达了双特异性单链抗体VE-scDb.VE-scDb具有良好的体外肿瘤靶向性,并可能有效的抑制结直肠癌细胞HT-29的体内外增殖.该设计为抗肿瘤治疗提供了新的思路,有潜在的临床应用前景.
关键词： 血管内皮生长因子受体2 表皮生长因子受体 结直肠癌 双特异性单链抗体 -
靶向HER2/EGFR分子双特异性单链抗体的构建及其体内外抗乳腺癌的研究
目的 构建一种可以同时靶向抑制人类表皮生长因子受体2(HER2)和表皮生长因子受体(EG-FR)分子的双特异性单链抗体,从而降低单一通路抑制而造成的耐药性,增强抗肿瘤效果.方法 采用Overlap PCR法通过柔性肽(G4S)将曲妥珠单抗的可变区与西妥昔单抗连接,构建工程载体,并通过大肠埃希菌系统进行表达纯化,获得同时靶向HER2和EGFR的双特异性单链抗体;流式细胞术检测双特异性单链抗体对EGFR和HER2过表达的乳腺癌细胞BT474的结合能力;噻唑蓝(MTT)法检测单链抗体对BT474乳腺癌细胞的增殖抑制;建立BT474荷瘤小鼠动物模型,检测双特异性单链抗体的体内抗肿瘤活性;使用免疫组织化学检测单链抗体是否可以抑制表皮生长因子受体(EGFR)的磷酸化,并对肿瘤细胞增殖指标Ki-67进行检测.结果 通过基因工程手段和毕赤酵母表达及镍柱纯化,成功获得双特异性单链抗体,经蛋白印迹法鉴定验证了双特异性单链抗体表达及装配正确.流式细胞术检测双特异性单链抗体与乳腺癌细胞B T 474的结合率为53.3％,与曲妥珠单抗(69.0％)、西妥昔单抗结合率(60.3％)相当.MTT法中,与磷酸盐缓冲液(PBS)组相比,曲妥珠单抗组、西妥昔单抗组与双特异性单链抗体组对乳腺癌细胞BT 474均有抑制作用,且抑制作用呈浓度依赖性.在蛋白水平为400 nmol/L时,双特异性单链抗体组抑制率[(65.19±4.21)％]强于曲妥珠单抗组[(40.67±1.78)％]与西妥昔单抗组[(32.20±2.94)％].通过裸鼠移植瘤模型的体内抗肿瘤实验,双特异性单链抗体组在体内仍能发挥较强的抗肿瘤效果,高剂量组肿瘤抑制率可以达到(74.32±4.37)％,明显优于曲妥珠单抗组(44.83±6.02)％ 与西妥昔单抗组(39.44±8.75)％.通过免疫组织化学对给药后的肿瘤组织进行分析,与PBS组相比,双特异性单链抗组可以明显抑制BT474皮下移植瘤组织中p-EGFR、Ki-67的表达量.结论 采用毕赤酵母表达体系成功构建并表达了双特异性单链抗体.双特异性单链抗体具有良好的体内外抗肿瘤活性,有效抑制乳腺癌细胞BT474的体内外增殖,并通过免疫组织化学分析到双特异性单链抗体可以抑制EGFR的磷酸化并抑制肿瘤细胞的增殖,为抗肿瘤治疗提供了新的思路,有潜在的临床应用前景.
关键词： 人类表皮生长因子受体2 表皮生长因子受体 乳腺癌 双特异性单链抗体 -
双特异性单链抗体介导的T细胞对前列腺癌细胞的杀伤作用
目的 研究并比较两种抗人γ-精浆蛋白/抗CD3双特异性单链抗体介导T细胞杀伤前列腺癌细胞的作用.方法 利用流式细胞仪分析双特异性单链抗体(BsAb)及多价双特异性单链抗体(mBsAb)与LNCaP细胞和Jurkat细胞的亲和力;将LNCaP细胞作为靶细胞,分为抗体浓度固定组和效应细胞/靶细胞比例固定组,利用51Cr释放试验评价两种双特异性单链抗体在体外介导T细胞杀伤靶细胞的能力;将Jurkat细胞种植裸鼠后,建立裸鼠前列腺癌模型,并分为非治疗组、对照组、BsAb组和mBsAb组,进一步评价两种双特异性单链抗体在体内介导T细胞杀伤靶细胞的能力.结果 流式细胞仪结果显示:BsAb和mBsAb均可特异性结合LNCaP细胞和Jurkat细胞,阳性结合率分别为56.3%、55.4%和74%、83%.51Cr释放试验结果显示:在体外,BsAb和mBsAb均可介导T细胞对前列腺癌细胞的杀伤,并且T细胞的杀伤效率与抗体浓度和效应细胞/靶细胞比例呈正相关.与非治疗组和对照组比较,接种前列腺癌细胞的裸鼠在体内注射激活的细胞毒T细胞的同时分别接受两种抗体的治疗后,肿瘤生长均明显受到抑制(P＜0.05).另外,体外介导杀伤作用和体内抑制肿瘤生长等方面,多价双特异性抗体的效果明显优于双特异性抗体.结论 同时识别人γ-精浆蛋白和CD3分子的双特异性单链抗体可有效地介导T细胞对前列腺癌细胞的杀伤作用,并且双特异性单链抗体四聚体的形成可明显改善抗体介导杀伤作用的效率.
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抗EGFR/VEGF双特异性单链抗体的构建及其抗卵巢癌SKOV-3的研究
目的 将表皮生长因子受体(EGFR)和血管内皮生长因子(VEGF)同时进行靶向治疗,可协同抑制作用,增强抗肿瘤效果.方法 使用重叠聚合酶链式反应(PCR)手段,西妥昔单抗的可变区和贝伐珠单抗的可变区通过G4S柔性肽连接在一起,获得同时靶向EGFR和VEGF的双特异性单链抗体(scDb);通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测scDb与EGFR和VEGF的结合活性,并计算亲和力常数;流式细胞术检测scDb对受体过表达的卵巢癌细胞系SKOV-3的结合能力;MTT法检测scDb对卵巢癌细胞系SKOV-3的增殖抑制;Western Blot研究与单独给药相比 scDb对 SKOV-3相关信号通路的影响;建立卵巢癌SKOV-3细胞荷瘤小鼠动物模型,检测scDb的体内抗肿瘤活性.结果 通过重叠PCR手段和毕赤酵母X-33表达,成功获得scDb,经Western blot鉴定验证了scDb的分子量为55kD,证明表达及装配正确.ELISA检测scDb与EGFR和VEGF均有结合活性,通过EC50计算,得到scDb与EGFR的亲和力常数为1.27nM,与VEGF的亲和力常数为0.75nM.流式细胞术检测scDb与SKOV-3的结合率为72.00%.MTT实验,亲本抗体组与双特异性单链抗体组对SKOV-3均有抑制作用.通过Western blot实验表明,scDb能同时阻断EGFR和激酶结构域受体(KDR)的磷酸化,终导致丝氨酸/苏氨酸激酶等信号通路被强烈抑制.通过SKOV-3细胞裸鼠移植瘤模型的体内抗肿瘤实验,scDb组在体内仍能发挥较强的抗肿瘤效果,高剂量组肿瘤抑制率可以达到(74.53±9.63)%.结论 该文成功构建并表达了scDb.scDb具有良好的体内外抗肿瘤活性,为抗肿瘤治疗提供了新的思路,有潜在的临床应用前景.
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双特异单链抗体靶向治疗急性白血病
目前除急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）以外的急性白血病（ acute leukemia，AL）疗效堪忧，急需研发新的治疗药物。采用基因工程抗体技术制备的双特异性单链抗体能同时结合两个特异性抗原，与其他抗体药物相比有明显的优越性，是一种有很好临床应用前景的免疫治疗药物，本文对双特异性单链抗体靶向治疗急性白血病的新进展做一综述。
