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强力霉素调控血小板生成素在CHO细胞中的表达
本实验应用Tet-On基因表达系统,通过强力霉素调控血小板生成素(TPO)基因在CHO细胞中的表达.应用DNA重组技术,构建质粒pTRE-TPO.应用脂质体介导的基因转染技术,pTRE-TPO与pTK-Hyg共转染CHO-Tet-On细胞株,得到双稳定细胞株CHO-Tet-On-TPO,并筛选高表达、低背景克隆.当培养基中不加强力霉素时,RT-PCR和Western印迹未见TPO表达,ELISA测定培养上清TPO水平为0.1μg/L.当培养基中加入2mg/L强力霉素时,RT-PCR和Western印迹可见TPO表达条带,ELISA测定培养上清TPO水平为10.8μg/L,两者相差108倍.本试验通过强力霉素调控TPO基因在CHO细胞中的表达,有望为TPO基因治疗提供一条可控的安全途径.
关键词： 血小板生成素 Tet-On基因表达系统 强力霉素 基因表达调控 CHO细胞 -
Tet-on基因表达系统调控HIF-1α表达对肝癌细胞凋亡的影响
目的 探讨HIF-1α表达在体外对肝癌细胞凋亡的影响.方法 利用Tet-on基因表达系统调控HePG2细胞HIF-1α的表达,观察细胞凋亡.结果 酶切和DNA测序证实Tet-on基因表达系统反应质粒pTRE-HIF-1α构建成功.获得了受强力霉素调控、稳定表达HIF-1α的肝癌细胞.经阿霉素诱导凋亡后,强力霉素终浓度为0μg/ml、0.02 μg/ml、0.2 μg/ml、1 μg/ml、2μg/ml、5μg/ml时的细胞凋亡率分别为59.6%、50.9%、38.1%、30.5%、23.9%、18.3%;强力霉素0.02 μg/ml、0.2 μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml处理细胞后,Casepase-3活性分别降低了2.3、5.5、8.7、12.6、18.8倍.RT-PCR检测结果显示,随着强力霉素浓度的增加,HIF-1α表达水平增加,Survivin和Bcl-2基因表达强度逐渐增加,差异有统计学意义(P＜0.001).结论 HIF-1α基因在体外可以抑制肝癌细胞凋亡,而且随着HIF-1α表达水平的增加,对肝癌细胞的凋亡抑制作用进一步加强,可能与HIF-1α诱导survivin和Bcl-2的表达及抑制casepase-3的活性有关.
关键词： 癌 肝细胞 细胞凋亡 HIF-1α基因α Tet-On基因表达系统 -
缺氧诱导因子1α的表达对HepG2细胞增殖与凋亡的影响
目的 观察缺氧诱导因子1α(HIF-1α)对HepG2细胞增殖相关CyclinD1、CyclinA基因与凋亡相关Survivin、Bcl-2基因的影响.方法 对Tet-on基因表达系统调控的缺氧诱导因子1α转染入HepG2细胞,用不同质量浓度的强力霉素对受强力霉素调控、稳定表达HIF-1α的HepG2Tet-on进行凋亡诱导,检测肝癌细胞的凋亡和HIF-1α、CyclinD1、CyclinA、Survivin、Bcl-2的基因表达.结果 终浓度分别为0、0.1、1、5 mg/L的对HIF HepG2Tet-on进行细胞凋亡诱导,细胞凋亡率分别为56.4%±7.8%、42.7%±4.9%、31.5%±6.1%、19.7%±4.5%;随着强力霉素浓度的增加,HIF-1α、CyclinD1、CyclinA、Survivin、Bcl-2基因表达水平增加,差异有统计学意义(P <0.01). 结论 HIF-1α基因在体外可以促进HepG2细胞的增殖,抑制其凋亡,而且随着HIF-1α基因表达水平的增加作用不断增强,这可能与HIF-1α诱导CyclinD1、CyclinA、Survivin、Bcl-2基因表达有关.
关键词： 肝肿瘤 细胞增殖 凋亡 HIF-1α Tet-On基因表达系统 -
诱导性鼠Smad7真核表达载体的构建与鉴定
目的 构建四环素诱导性鼠Smad7真核表达载体.方法 采用常规分子生物学方法,抽提SD大鼠肾脏总RNA,RT-PCR获得鼠Smad7 cDNA,再定向克隆于四环素诱导性真核表达载体pBI-L多克隆位点Nhe Ⅰ和Hind Ⅲ之间,限制性内切酶酶切和测序鉴定.结果 重组pBI-L-Smad7真核表达载体经限制性内切酶酶切分析和测序分析,与理论值相符.结论 本实验成功构建鼠Smad7四环素诱导性真核表达载体pBI-L-Smad7,为今后临床开展组织器官纤维化Smad7基因治疗奠定实验基础.
关键词： 鼠Smad7 Tet-On基因表达系统 纤维化 基因治疗 -
可调控的鼠白细胞介素-12双亚基共表达质粒的构建及在体外表达
目的 构建可经米非司酮(RU486)调控表达小鼠白细胞介素-12(mIL-12)单链融合基因的真核载体, 并鉴定其调控表达效果.方法 以GCp35Ep40PN质粒为模板,分别获取mIL-12 p40和p35亚基的基因, 重叠PCR引入linker后,克隆入pCA14质粒,测序正确之后,装入可调控载体pRS-17而构建成真核表达质粒pRS-RUmIL-12.用Lipofectamine 2000将pRS-RUmIL-12质粒转染HEK293细胞,以不同剂量的RU486诱导其表达,然后用ELISA法检测其培养上清液中mIL-12蛋白的含量.结果 所得mIL-12单链融合基因序列与设计一致.pRS-RUmIL-12在体外转染HEK293细胞后,ELISA检测结果 表明该系统具有良好的调控能力: 无诱导剂RU486时,mIL-12蛋白表达量很低,而加入诱导剂RU486后,可以诱导mIL-12的表达,并在一定范围内mIL-12的蛋白表达量与诱导剂的浓度呈正相关.结论 成功构建了可经RU486调控的mIL-12双亚基共表达的真核表达质粒,可用于进一步的基因调控和基因治疗研究.
关键词： 低氧诱导因子-1α 巢式PCR Tet-On基因表达系统 反应质粒 克隆
