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GITRL联合IL-21基因真核表达载体的构建及体外研究
本研究构建人糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体配体(GITRL)联合白介素-21(IL-21)基因真核表达载体,为探讨目的基因对慢性髓系白血病(CML)来源树突状细胞(DC)的影响.应用脂质体介导法将重组真核表达载体转染至纯化的DC,而此纯化的DC来源于经伊马替尼治疗有效或无效的慢性期CML患者或健康志愿者.应用ELISA法检测转染后DC细胞因子的浓度变化.将转染后的DC与纯化的自体NK混合培养使之成为DC-CIK.以DC-CIK细胞为效应细胞,应用乳酸脱氢酶释放法观察其对靶细胞的杀伤率.结果表明:所获目的基因经测序 与GenBank比对序列一致,PCR及限制性核酸内切酶检测显示,真核表达载体质粒经限制性酶切鉴定片段大小正确,并均可转染至伊马替尼治疗有效、无效的慢性期CML患者及健康志愿者来源的DC细胞.成功转染相应载体后的DC分别表现出IL-2和IFN-γ分泌量增加;细胞毒活性试验表明,转染后的DC可增加自体NK细胞对K562细胞的杀伤活性.结论:DC能够通过转染IL-21和GITRL基因的方式获得自我活化、上调自身细胞因子分泌的能力,为酪氨酸激酶抑制剂治疗无效的CML患者的免疫治疗奠定了理论依据和实验基础.
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小鼠GITRL融合蛋白的表达、纯化及免疫原性的研究
目的:构建含小鼠GITRL基因原核表达载体,经转化E.coli以表达GITRL融合蛋白,纯化蛋白并制备相应的抗血清.方法:将GITRL-pMD18-T重组质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切回收目的基因,与原核表达载体PET32a连接,应用电转法转化BL21(DE3)菌.阳性克隆经鉴定后用IPTG诱导GITRL蛋白表达,经Ni+-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE、Western blot进行特异性鉴定,CD4+CD25+T细胞免疫抑制试验验证其生物学功能.采用弗氏完全佐剂常规免疫方案,制备抗GITRL抗血清,抗血清的效价和特异性测定采用双向琼脂免疫扩散法.结果:经酶切鉴定和测序分析证实原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示,在40 kD处呈现单一蛋白条带,该蛋白具有阻断CD4+CD25+T细胞免疫抑制功能的作用,双向免疫扩散结果显示兔抗小鼠GITRL抗血清效价为1∶16.结论:成功构建GITRL原核表达质粒,制备和纯化的GITRL融合蛋白具有较好的纯度和生物学功能,制备并获得特异性抗血清,可用于GITRL融合蛋白生物学活性的进一步研究.
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FOXP3和GITR/GITRL mRNA在类风湿关节炎和结直肠癌患者外周血中的表达研究
探讨FOXP3和糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor,GITR)及其配体(GITRL)在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)和结直肠癌患者中的表达变化及GITR与FOXP3表达的相关性.运用实时荧光定量RT-PCR方法,检测55例健康体检者、55例RA患者、50例结直肠癌患者的外周血单个核细胞(peripheral blood monocytes,PBMC)中FOXP3、GITR和GITRL的基因表达水平.结果:在RA患者组FOXP3、GITR和GITRL均显著低于健康对照组(P＜0.01),经过转换后的mRNA表达水平分别为对照组的18.5%、7.5%和1.7%,GITR和FOXP3的表达水平呈显著正相关(r=0.86,P＜0.01);而在结直肠癌患者组,FOXP3的表达水平显著高于对照组(P＜0.01),表达水平为对照组的173.7%,GITR和GITRL的表达水平显著低于对照组(P＜0.01),mRNA表达水平为对照组的45.7%和50.1%,GITR和FOXP3的表达有一定的相关性(P=0.046).RA和结直肠癌患者均存在调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)异常.在RA中,GITR表达趋势与FOXP3一致,均反映Treg数量或功能降低.但在结直肠癌患者中,两者表达不尽一致.
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哮喘小鼠肺组织Nuocytes增多与GITR-GITRL表达的关系
目的：检测哮喘小鼠肺组织中Nuocytes相关指标和GITR-GITRL的表达，探讨哮喘时Th2极化微环境的改变。方法：选择8只Balb／c小鼠，随机分为2组，模型组于第1天，第11天用OVA致敏，第22至26天用2％OVA溶液雾化激发，对照组用PBS处理；采用流式细胞术检测小鼠肺组织内GITR表达和Nuocytes细胞数量；qRT-PCR法检测Foxp3、RORα、ICOS、ST2、IL-5、IL-13和GITR及其配体GITRL的mRNA表达水平；对GITR-GITRL和Nuocytes及其相关分子的表达水平进行相关性分析。结果：与对照组相比，模型组小鼠肺组织中Nuocytes细胞数和GITR表达均升高，且GITRL、Foxp3、RORα、ICOS、ST2以及IL-5和IL-13 mRNA表达水平均明显上调；GITR与RORα和ST2、IL-5、IL-13的表达水平均呈正相关。结论：哮喘小鼠肺组织中Nuocytes和GITR-GITRL表达增高，提示哮喘时GITR-GITRL上调的T细胞免疫应答可能与Th2主导的免疫失衡和Nuocytes极化相关。
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GITRL基因SNP-rs2236876分型方法的比较
目的：对3种单核苷酸多态（single nucleotide polymorphism，SNP）分型方法进行比较，选择准确有效的SNP分型方法对GITRL SNP-rs2236876A／G进行基因分型。方法：采用Taqman-MGB探针法，限制性片段长度多态性聚合酶链式反应（cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites，PCR-RFLP ）法和直接测序法对 GITRL SNP-rs2236876A／G进行分型并比较。结果：PCR-RLFP法分型结果直接通过电泳图可见，适合少量的实验对象；Taqman-MGB探针法通过不同的荧光区分不同的基因型，适合大量的实验对象；直接测序法交由测序公司测定，样本数量浮动范围较大，费用较高。结论：Taqman-MGB探针法适用于GITRL基因rs2236876A／G基因分型，PCR-RFLP法适用于基因分型结果的验证，直接测序法适用于鉴定有争议的PCR-RFLP法的验证结果。
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mGITRL真核表达质粒的构建及其在Lewis细胞中的表达
目的:构建含小鼠GITRL基因的真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL,体外转染小鼠肺癌细胞株Lewis细胞.方法:利用PCR方法扩增mGITRL基因,克隆至pIRES2-eGFP载体,选择阳性克隆并进行序列测定.以电穿孔法转染Lewis细胞,通过G418筛选,获得稳定表达细胞株.结果:构建了真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL,基因测序与GenBank中发表的序列完全一致,体外转染Lewis细胞,经G418筛选,体外传代30代以上,RT-PCR及流式细胞仪检测该细胞株稳定表达mGITRL.结论:成功构建了真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL,并在小鼠Lewis细胞中稳定表达,为进一步研究GITRL的生物学功能提供研究基础.
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GITRL在脂多糖所致树突状细胞免疫麻痹中的作用
目的 观察脂多糖所致脓毒症小鼠树突状细胞GITRL表达及免疫功能的改变.方法 以10 ng/mL脂多糖刺激体外诱导小鼠树突状细胞模拟脓毒症免疫麻痹体系,利用流式细胞术和BrdU细胞增殖反应试剂盒分别检测树突状细胞表面分子CD11c、CD80和GITRL表达、混合淋巴细胞增殖反应及CD4+CD25+Foxp3+Treg水平.结果 脂多糖引起树突状细胞标志分子CD11c、CD80和负调控分子GITRL的表达分别由6.97％、2.61％和22.39％增加到16.02％、13.35％和49.74％,差异均有统计学意义(P＜0.01).平均荧光密度值由4.81增加到17.95,差异有统计学意义(P＜0.01).然而抗原特异性混合淋巴细胞反应OD值由0.532减少为0.419,差异有统计学意义(P＜0.01),并且GITRL激活的CD4+CD25Toxp3+Treg由5.71％增加到8.31％,差异有统计学意义(P＜ 0.05).结论 脂多糖所致脓毒症小鼠树突状细胞表达高水平的免疫共抑制GITRL分子,通过GITRL-GITR激活Treg细胞抑制T细胞增殖和功能,引起免疫麻痹状态.
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hGITRLaa52-177蛋自在杆状病毒系统中的表达
目的 利用杆状病毒系统表达hGITRLaa52-177蛋白.方法 PCR扩增获得hGITRL胞外段(hGITRLaa52-177)基因,克隆入pFastBacHTa转移载体,在E.coli DH10Bac内通过转座子Tn7的介导,得到重组杆粒,转染Tn细胞表达目的蛋白.通过SDS-PAGE电泳及Western blotting鉴定目的蛋白的表达.结果 重组载体 pFastBacHTa-hGITRLaa52-177以及重组杆粒Bacmid-hGITRLaa52-177构建正确,在Tn细胞内成功表达6×His-hGITRLaa52-177重组蛋白,SDS-PAGE电泳及Western blotting显示重组hGITRLaa52-177蛋白相对分子质量约为Mr 18 000.结论 杆状病毒-昆虫表达系统获得 hGITRLaa52-177蛋白,为进一步从蛋白质水平研究hGITR/hGITRL对机体免疫调节的影响奠定了基础.
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Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达小鼠GITRL蛋白并鉴定
目的:利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达小鼠糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体的配体(GITRL)蛋白.方法:用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切GITRL-PMD18T载体,回收目的基因GITRL,并定向克隆入穿梭质粒pFastBacHTA中.以pFastBacHTA-GITRL转化感受态DH10Bac细菌,在DH10Bac细菌内重组pFastBacHTA与杆粒发生转座.筛选阳性克隆,提取重组杆粒,转染Tn昆虫细胞株,获取完整的重组杆状病毒.反复感染Tn细胞,扩增病毒同时表达目的蛋白,用Western blot法进行蛋白鉴定.结果:经核苷酸序列测定及PCR鉴定,成功地获得含GITRL基因的重组杆粒.在杆粒转染的Tn细胞中表现有细胞病变,推断转染成功并获得蕈组杆状病毒.Western blot法鉴定显示,在Mr 20000处有特异性的蛋白条带.结论:利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功地表达了小鼠GITRL蛋白,为进一步研究其生物学活性及功能奠定了实验基础.
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GITR/GITRL系统在免疫调节中的作用
糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor, GITR) 是肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)中的第18个成员, 是胸腺来源的CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)上的一个表面分子, 其配体为GITRL.
关键词： 糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体 GITR GITRL 免疫调节 -
FOXP3、GITR和GITRL在口腔扁平苔藓患者外周血中的表达
目的:研究FOXP3和GITR/GITRL基因在口腔扁平苔藓(OLP)患者外周血中的表达水平.方法:采用实时荧光定量RT- PCR的方法,检测30例OLP患者和15例健康人外周血中FOXP3、GITR和GITRL的基因表达水平.结果:OLP组FOXP3、GITR和GITRL mRNA表达量均显著低于健康对照组(P＜0.01)；结果经2- ΔΔCT转换后,OLP组FOXP3、GITR和GITRL mRNA表达水平分别是健康对照组的23.4％、18.1％和20.9％；FOXP3和GITR的表达水平呈正相关关系(r=0.491,P＜O.05).结论:FOXP3和GITR/GITRL mRNA的表达异常,影响了调节性T细胞(Treg)的功能.
关键词： 口腔扁平苔藓 实时荧光定量RT- PCR FOXP3 GITR GITRL
