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MicroRNA-17-92与肿瘤
microRNA是一类在生物体中广泛表达的、非编码调节性小分子RNA(约22～24nt).它们一经问世,即被发现参与多种疾病的发生.miR-17-92及其旁系同源序列就是其中之一,它们已被证实在肺、心脏及免疫系统的正常发育及肿瘤形成中均起到重要作用.本文从miR-17-92及其旁系同源序列在不同肿瘤组织中的表达及其在肿瘤发生中的分子机制,对这一基因簇与肿瘤发生的关系进行综述.
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miR-17-92在急性肝脏损伤中的功能和作用
目的：利用体外细胞模型和基因敲低模型评价 miR-17-92在急性肝脏损伤中的作用。方法利用慢病毒 LV-miR-17-92感染正常人肝细胞系L02，获得稳定过表达 miR-17-92肝脏 L02细胞，利用四氯化碳模拟肝细胞损失，MTS 法检测 miR-17-92高表达L02细胞和对照细胞的存活率。利用 Alb-cre 转基因小鼠和 miR-17-92-loxp 转基因小鼠杂交，获得肝脏组织特异的miR-17-92基因敲低小鼠。利用四氯化碳和伴刀豆球蛋白A，分别建立两种急性小鼠肝损伤模型。取肝脏组织进行 HE染色，眼球取血检测谷丙转氨酶、谷草转氨酶，进而评价miR-17-92在急性肝脏损伤中的功能和作用。结果 Q-PCR 结果显示慢病毒感染显著提高了 L02细胞中 miR-17-92的表达。MTS 结果显示四氯化碳处理明显抑制了 L02细胞的生长，而与对照组相比，miR-17-92过表达提高了四氯化碳处理后细胞的存活率（P <0.05）。基因组PCR 结果和肝脏 Q-PCR 分析均显示肝脏特异 miR-17-92基因敲低小鼠肝脏中 miR-17-92的表达显著降低。小鼠腹腔四氯化碳给药能够显著诱导野生型小鼠肝脏 miR-17-92的水平，而基因敲低小鼠中 miR-17-92表达无明显变化。在四氯化碳和伴刀豆球蛋白 A 肝脏损伤模型中，与对照组相比，miR-17-92肝脏特异性敲低小鼠的肝脏病理学损伤明显加重，提示 miR-17-92可能参与了急性肝损伤的修复过程。结论肝脏损伤能够诱导 miR-17-92表达增加，而miR-17-92过表达对四氯化碳诱导的肝细胞损伤具有保护作用，miR-17-92敲除则加重了四氯化碳和伴刀豆球蛋白 A诱导的急性肝损伤。因此，miR-17-92在急性肝脏损伤中起保护作用。
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尾静脉注射及皮下接种方法建立小鼠高表达miR-17-92的 L1210白血病模型的比较研究
目的对尾静脉注射及皮下接种方法构建的小鼠高表达miR-17-92的L1210白血病模型的生物学特性进行比较研究，选择基本符合高表达miR-17-92的L1210细胞生物学特性，且一致性更好的接种方法。方法常规培养小鼠高表达miR-17-92的L1210系，分别给DBA/2N小鼠以尾静脉注射细胞浓度100×104（A组）、细胞浓度300×104（B组），皮下注射途径接种右上肢根部细胞浓度300×104（C组），观察小鼠成瘤情况，定期计数各组小鼠外周白细胞数量并观察细胞形态改变，取濒死小鼠的肝、脾、肺、肾等脏器称重并制作病理切片。结果各组小鼠成瘤率均为100％， A、B、C 三组平均存活天数分别为：（24.3±3.64） d、（14.2±3.42）d、（26.4±5.56）d。均于接种第8天尾静脉取血，外周血白细胞数目分别为（9.96±2.03）×109/L、（10.81±1.70）×109/L、（12.76±2.06）×109/L，外周血白血病细胞比例分别为（21.33±2.78）％、（32.17±6.5）％、（10.0±2.0）％；接种第15天外周血白细胞数目分别为（8.07±1.31）×109/L、（5.02±1.22）×109/L、（13.28±2.08）×109/L，外周血白血病细胞比例分别为（32.83±3.50）％、（49.67±7.00）％、（12.66±2.00）％。各组濒死小鼠脾有弥漫性白血病细胞浸润，正常组织结构被破坏；肝散在白血病细胞浸润，正常组织结构部分被破坏；肺和肾内有少量白血病细胞浸润，正常组织结构破坏不明显，肺脏有明显出血。结论尾静脉注射及皮下注射高表达miR-17-92的L1210细胞均可使DBA/2小鼠成瘤，尾静脉注射更符合白血病的生物学特点。尾静脉注射高表达miR-17-92的L1210细胞浓度100×104存活时间长，外周血白血病细胞比例较高，适宜观察周期较长的实验。尾静脉注射高表达miR17-92的L1210细胞浓度300×104存活时间短，不适宜观察周期较长的实验；皮下注射可见明显的瘤结节，存活时间长，适宜观察周期长的实验，但外周血白血病细胞比例偏低。
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高表达 miR-17-92的 L1210细胞系的构建与鉴定
目的以小鼠白血病L1210细胞系为基础，构建稳定高表达miR-17-92的细胞系。方法采用核转法，将miR-17-92的过表达质粒MSCV-LMP-miR-17-92、对照质粒MSCV-LMP转导入L1210细胞系；利用含嘌呤霉素选择、荧光倒置显微镜下观察、流式细胞术等技术筛选阳性克隆并检测转染效率；并用qPCR技术验证构建的阳性细胞系中的靶标miRNA表达水平，验证miR-17-92相对过表达比例。结果成功将MSCV-LMP-miR-17-92、MSCV-LMP转入L1210细胞系，转染效率较高，利用含嘌呤霉素的培养基筛选核转后的细胞，阳性率达到99％以上，miR-17-92簇中的靶标miRNA表达量持续。结论通过核转仪转染法成功将MSCV-LMP-miR-17-92、MSCV-LMP（对照质粒）转入L1210细胞系，并通过长期药物筛选获得了稳定表达细胞系，为进一步研究该基因在肿瘤中的作用提供了实验平台。
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miR-17-92基因簇在肿瘤发生发展中作用的研究进展
肿瘤是威胁全世界人类健康和影响社会经济的重要因素.近年来,随着经济的发展,肿瘤的发病率呈明显上升趋势,但是其病因尚未完全阐明.越来越多的证据显示肿瘤的发生和遗传因素有关,随着病理生理学和遗传学的发展,许多学者认为生物标志物可以预测癌症甚至指导临床治疗.微小RNA(microRNA,miRNA)是非编码小分子RNA,在发育、生理、病理过程以及肿瘤发生等环节中起着重要的调节作用.miR-17-92基因簇是研究较为深入、有特点的miRNA,被认为是原癌基因mi RNA的代表,在多种肿瘤的发生发展中起着至关重要的作用.本文就miR-17-92基因簇在肿瘤发生发展中的作用及功能进行综述.
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MicroRNA-17-92基因对胃癌干细胞更新和增殖的影响
背景：研究表明，miRNA 对肿瘤干细胞的更新分化有调节作用，有关 miRNA-17-92在胃癌干细胞更新及增殖中的作用尚未完全阐明。
目的：分析miRNA-17-92在胃癌干细胞自我更新及增殖中的作用。
方法：①利用细胞培养使胃癌干细胞贴壁分化并送miRNA芯片检测，寻找并验证不断缺失的miRNA。②构建并转染miRNA-17-92分子慢病毒稳定转染细胞。③通过tumorsphere实验研究miRNA-17-92与胃癌细胞更新的关系。④通过MTT、平板克隆试验检测miRNA-17-92与胃癌干细胞增殖的关系。
结果与结论：①miR-19b/20a/92a在胃癌干细胞贴壁分化过程中表达逐渐减低。②慢病毒携带的miRNA-17-19基因在MKN28细胞和CD44-/EpCAM-细胞中的表达均明显增加；瞬时转染pre-miR-19b/20a/92a能使CD44-/EpCAM-和MKN28的miRNA表达增高，瞬时转染pre-miR-19b/20a/92a拮抗剂能使SGC7901和CD44+/EpCAM+的miRNA表达降低；过表达lenti-miR-19b/20a/92a能显著增加胃癌细胞形成肿瘤球的能力；在化疗药的作用下，lenti-miR-19b/20a/92a感染细胞的生存时间延长；瞬时转染pre-miR-19b/20a/92a 能够显著增加CD44+/EpCAM+细胞数，转染其拮抗剂可以降低CD44+/EpCAM+细胞数。③miR-19b/20a/92a稳定表达组的胃癌细胞增殖速度较对照组快。瞬间转染miR-19b/20a/92a前体组加快胃癌细胞的增殖速度，而瞬时转染其拮抗物组减慢胃癌细胞的增殖速度；瞬间转染 miR-19b/20a/92a前体组的克隆数较对照组多，而瞬时转染miR-19b/20a/92a拮抗物组的克隆数较对照组少。结果表明miR-19b/20a/92a基因在胃癌干细胞分化过程中不断缺失，miR-17-92基因能够促进胃癌干细胞的更新和增殖。 -
miR-17-92启动子区多态性在广西人群中分布及与淋巴细胞关系
目的:研究广西人群中miR-17-92基因簇启动子区rs9515692C/T和rs1352743A/G多态性分布特点和在不同人群间分布差异,探讨其多态性和淋巴细胞的关系.方法:采取多重单碱基延伸法(SNaPshot)和DNA测序法进行基因分型.运用流式细胞仪检测淋巴细胞数.数据分析利用SPSS17.0统计学软件.结果:2位点基因型及等位基因频率在广西人群的不同性别间差异无统计学意义(P>0.05).rs9515692C/T和rs1352743A/G基因型及等位基因频率与国际人类基因组单体型图计划(HapMap)公布的欧洲、日本和非洲人群的比较差异有统计学意义(P<0.05).结论:rs9515692C/T和rs1352743A/G基因多态性在不同人群中存在着不同程度差异.此外,rs9515692C/T多态性与B淋巴细胞数有关.
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miR-17-92对急性白血病L1210/DDP细胞多药耐药性影响研究
目的:研究miR-17-92在白血病L1210/DDP细胞多药耐药形成中的作用.方法:首先构建L1210/DDP耐药细胞系,运用real-time PCR方法检测miR-17-92在L1210/DDP细胞与L1210细胞中的表达差异.利用脂质体Lipofectamine 2000将miR-17-92抑制物(miR-17-92sponge)及阴性对照(sponge vector)转染L1210/DDP细胞,构建miR-17-92表达下调的L1210/DDP细胞系.用MTS法检测转染后耐药细胞对顺铂和阿霉素体外药物敏感性.结果:miRNA-17-92在L1210/DDP耐药细胞系中高表达,上调倍数为(1.61±0.01)倍.体外药物敏感性实验表明,转染miR-17-92抑制物的实验组对顺铂和阿霉素的IC50分别为(3.29±0.51)、(1.35±0.13)g/ml,而转染阴性对照组对上述药物的IC50分别为(6.73± 0.82)、(2.66±0.42)g/ml,在耐药株中抑制miR-17-92在L1210/DDP细胞中的表达,显著增加细胞对顺铂和阿霉素的敏感性.结论:miR-17-92在白血病耐顺铂L1210/DDP细胞中高表达.抑制miR-17-92的表达可增加白血病L1210/DDP细胞对顺铂和阿霉素化疗药物的敏感性,部分逆转耐药.
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miR-17-92基因簇增强前列腺癌DU145细胞的迁移、侵袭能力及对顺铂的耐药性
背景与目的:miR-17-92基因簇与多种疾病的发生密切相关,其在肺癌、肝癌、胃癌和前列腺癌等多种肿瘤细胞中均高表达.本研究利用慢病毒包装系统建立稳定高表达miR-17-92基因簇的DU145细胞株,探讨miR-17-92基因簇对前列腺癌DU145细胞的迁移、侵袭能力及对顺铂耐药性的影响.方法:构建高表达miR-17-92基因簇的表达载体,转染DU145细胞株,同时转染空载体作为对照,并用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time lfuorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)进行鉴定.用xCELLigence系统监测细胞的迁移、侵袭能力及顺铂处理后的生长情况;通过划痕实验观察细胞的迁移情况;采用蛋白[质]印迹法(Western blot)、凝胶酶谱实验和RTFQ-PCR检测相关蛋白质和基因的表达以探讨miR-17-92增强DU145细胞的迁移、侵袭能力及对顺铂耐药性的相关机制.结果:DU145-miR-17-92细胞迁移速率和侵袭能力高于DU145-control细胞(P<0.01).DU145-miR-17-92细胞中整合素β1的蛋白质表达水平和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9,MMP-9)的活性显著高于DU145-control细胞.顺铂处理后,DU145-miR-17-92细胞的生长速度自12 h起快于DU145-control细胞并呈顺铂耐药性(P<0.01).细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases,ERK1/2)在DU145-miR-17-92细胞中呈现持续高水平磷酸化,顺铂处理后,其磷酸化水平无明显变化.DU145-miR-17-92细胞中切除修复互补交叉基因1(excision repair cross complementing1,ERCC1)的mRNA和蛋白质表达水平显著高于DU145-control细胞.结论:高表达miR-17-92增强了DU145细胞的迁移、侵袭能力,其机制与整合素β1的表达上调及MMP-9活性增强有关.此外,高表达miR-17-92增强了DU145细胞对顺铂的耐药性,该过程与ERK1/2的磷酸化水平增加和ERCC1的表达水平上调相关.
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miR-17-92基因簇在食管鳞癌的表达及其临床意义
目的 探讨miR-17-92基因簇在食管鳞癌中的表达,并分析其与肿瘤分化程度及预后的关系.方法 半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR方法分别检测58例ESCC组织和来自同一患者的邻近正常食管组织中miR-17-92的表达.采用Mann Whitney-U非参数检验和卡方检验比较低表达组和高表达组的临床病理特征和预后指标,采用Kaplan-Meier法分析miR-17-92表达水平与食管鳞癌患者生存时间之间的关系.结果 miR-17-92在所有的组织中都有表达,且在食管鳞癌组织中miR-17-92的表达高于正常食管组织(P＜0.001).miR-17-92在TNM分期越高、分化程度越低的肿瘤组织中表达越高(分别是P=0.032,P=0.035).另外,miR-17-92高表达的患者发生转移和死亡的风险明显增高,预后更差(P=0.038).结论 miR-17-92基因簇在食管鳞癌组织和邻近正常食管组织中表达存在差异性,可能在食管鳞癌发生、发展过程中起重要作用,有望成为食管鳞癌患者预后一种新的指标.
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从miRNA-17-92途径探讨小檗碱和吴茱萸碱对大肠癌HT29细胞周期调控机制
目的:探讨盐酸小檗碱和吴茱萸碱通过调控miR-17-92基因簇对大肠癌HT29细胞周期的作用机制,为中医药防治大肠癌提供实验依据.方法:体外培养人结肠癌HT29细胞,盐酸小檗碱(2.5,5.0,10.0μM)和吴茱萸碱(1.8,3.75,7.5μM)作用于稳定转染miR-17-5p和miR-20a的HT29细胞后,采用MTT法、流式细胞术、实时荧光定量PCR及Western印记法检测药物对HT29细胞增殖、细胞周期分布情况、mRNA表达水平及E2F1蛋白表达的影响.结果:盐酸小檗碱和吴茱萸碱可以抑制转染的HT29细胞增殖,具有时间依赖性;并且盐酸小檗碱和吴茱萸碱分别以浓度5.0、3.75μM作用转染HT29细胞72h后抑制率超过50％,因此盐酸小檗碱取2.5、10.0μM,吴茱萸碱取1.8、7.5μM用于后续实验,二者能够将细胞阻滞在S期,抑制miR-17-5p和miR-20a的表达水平及E2F1的蛋白表达.结论:盐酸小檗碱和吴茱萸碱通过靶向miR-17-92抑制E2F1蛋白的表达,将细胞阻滞在S期,进而抑制大肠癌HT29细胞的增殖,为中医药防治大肠癌提供新的靶点及实验依据.
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难治性急性淋巴细胞白血病患者外周血淋巴细胞miR-17-92表达研究
目的 探讨miR-17-92在难治性急性淋巴细胞白血病(RALL)患者外周血淋巴细胞中的表达情况.方法 用淋巴细胞分离液提取21例经2个疗程以上标准方案化疗未获缓解的RALL患者和15例体内敏感急性淋巴细胞白血病(ALL)患者外周血淋巴细胞,应用MTT法检测该36例白血病患者淋巴细胞对多柔比星和顺铂的敏感性,从体外实验结果与临床疗效相符患者的淋巴细胞中提取总RNA,应用实时荧光定量PCR法检测样品中miR-17-92的表达情况.结果 MTT法细胞敏感性实验表明,18例RALL患者淋巴瘤细胞抑制率(IR)＜30％,为不敏感或耐药,14例体内敏感ALL患者IR＞30％,为中度敏感或敏感；将此32例患者纳入本次研究对象.实时荧光定量PCR检测显示,与对化疗药物敏感ALL患者组相比,RALL患者淋巴细胞中miR-17-92相对表达量升高(7.12±1.03比3.21±0.63,P＜0.05).结论 miR-17-92在RALL患者淋巴细胞中的表达水平相对较高,这可能与RALL多药耐药的发生、发展相关.
