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SM22α在细胞骨架组构及血管重塑中的作用
血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化是动脉粥样硬化、高血压和血管成形术后再狭窄等血管重塑性疾病的共同病理生理过程.VSMC表型转化过程中平滑肌特异基因的表达变化和细胞骨架的组构是当前研究的热点问题之一.平滑肌22α(SM22α)是近年发现的一种VSMC分化标志物,其表达具有平滑肌组织特异性和细胞表型特异性,该蛋白作为一种肌动蛋白细胞骨架相关蛋白参与VSMC骨架组构和收缩调节.本文就SM22α的结构特征及其在VSMC骨架组构和血管重塑中的作用机制进行综述.
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miR-342-3p抑制SM22α启动子的转录活性
目的 探究miR-342-3p是否通过作用于SM22α启动子,从转录水平调控SM22α的表达.方法 通过软件RNAhybrid分析发现,大鼠SM22α启动子中存在一个miR-342-3p的识别位点.将miR-342-3p mimics与报告基因载体pGL3-SM22α-Promoter共转染293A细胞,通过检测荧光素酶活性来分析miR-342-3p对SM22α启动子转录活性的影响.将miR-342-3p mimics转染血管平滑肌细胞,采用qRT-PCR和Western blot分别检测SM22αmRNA和蛋白质水平,分析miR-342-3p对血管平滑肌细胞中SM22α表达的影响.结果 与miR-control相比,miR-342-3p能够使SM22α启动子转录活性降低(0.54±0.03)倍,差异有统计学意义(P＜0.05);与miR-control相比,miR-342-3p能够使血管平滑肌细胞中SM22α mRNA水平降低(0.45±0.04)倍,SM22α蛋白质水平下降(0.4l±0.05)倍,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 miR-342-3p通过抑制SM22α启动子活性,从转录水平降低SM22α的表达,为miRNA调控血管平滑肌细胞表型转化研究提供了新角度.
关键词： microRNA miR-342-3p SM22α 启动子 -
重组SM22αC端肽段促进细胞骨架重构
目的:探讨SM22αC端功能域肽段与细胞骨架F-actin聚合的关系,明确SM22α在血管平滑肌细胞(VSMC)骨架重构中的作用.方法:构建GST-SM22α C端功能域融合蛋白原核表达质粒pGEX3X-SM22α,诱导E coli高效表达可溶性GST-SM22α融合蛋白,制备抗SM22α抗体,VSMC蛋白分步提取及Western blot检测F-actin/G-actin中SM22α的含量变化,GST-pull down分析和免疫共沉淀检测SM22α与actin的相互作用,细胞免疫双荧光染色观察SM22α和actin在VSMC中的定位关系.结果:所构建的pGEX3X-SM22α原核表达质粒,在0.5 mmol/LIPTG,30℃诱导6 h条件下,表达可溶性GST-SM22α融合蛋白的水平高,用纯化的融合蛋白免疫新西兰白兔获得的抗血清效价为1:16.免疫双荧光染色和蛋白分步提取分析结果表明,在VSMC再分析过程中,SM22α与F-actin共定位,GST pull down分析和免疫共沉淀结果均显示,SM22α通过C端功能域与F-actin相互作用而参与细胞骨架的重构;但是,SM22α与G-actin的结合能力较弱.结论:本研究重组得到的SM22αC端功能域具有与F-actin结合的活性,SM22α通过该区域与actin相互作用而参与细胞骨架重构.
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平滑肌细胞纯化载体构建及在小鼠胚胎干细胞中的表达
背景:胚胎干细胞是平滑肌细胞重要的来源之一,但是胚胎干细胞分化细胞的异质性导致难以获得较纯的平滑肌细胞.目的:为进一步纯化胚胎干细胞来源的平滑肌细胞,拟在体外构建平滑肌特异性SM22α启动子驱动的嘌呤霉素抗性(puromycin acetyltransferase,pac)基因与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)基因双表达载体,即pSM22-PAC-IRES2-EGFP载体,并在胚胎干细胞中检测其有效性及特异性.设计、时间及地点:基因水平细胞观察实验,于2007-05/2008-09在解放军沈阳军区总医院全军心血管病研究所完成.材料:小鼠胚胎干细胞系R1购自美国ATCC公司,编号SCRC-1011~(TM).pSM22α-EGFP载体由本实验室构建;pIRES2-EGFP载体、pSM2C载体、pSuper.basic载体购自Invitrogen公司.方法:用聚合酶链反应方法从pSM22α-EGFP中扩增SM22α启动子,然后用该启动子替换pIRES2-EGFP载体中的CMV启动子,构建pSM22-IRES2-EGFP.再从pSM2C中用HindⅢ/Cla Ⅰ酶切获得pac基因,将pac基因片段亚克隆到pSuper.basic中,构建pSuper-PAC.后BgⅢ/Acc Ⅰ双酶切pSuper-PAC获得pac基因片段,将其插入到pSM22α-IRES2-EGFP,构建成pSM22α-PAC-IRES2-EGFP.将pSM22α-PAC-IRES2-EGFP用脂质体法转染胚胎干细胞,G418筛选阳性克隆.诱导胚胎干细胞阳性克隆分化,RT-PCR扩增pac基因鉴定阳性克隆.对分化细胞行平滑肌细胞标志物SMα-actin免疫荧光染色.主要观察指标:①pSM22α-PAC-IRES2-EGFP测序结果.②pac基因扩增.③荧光显微镜下同时观察分化细胞EGFP的表达及SMα-actin染色情况.结果:HindⅢ/Cla Ⅰ双酶切得到261 bp,664 bp,5 000 bp 3个片段,与预期结果一致,测序结果证实pSM22α-PAC-IRES2-EGFP构建成功.Pac基因扩增证实有4株胚胎干细胞克隆转染成功.转染成功的胚胎干细胞被诱导分化后,部分细胞表达EGFP,且这些细胞SMα-actin染色呈阳性.结论:实验成功构建了平滑肌细胞筛选载体pSM22α-PAC-IRES2-EGFP.成功转染这一载体的胚胎干细胞表达pac基因及EGFP基因,且EGFP表达具有平滑肌特异性.
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SM22α在血管平滑肌细胞中的作用
平滑肌22α(SM22α)是平滑肌细胞(VSMC)骨架相关蛋白,通过与肌动蛋白的作用参与VSMC骨架重构,是近年发现的一种VSMC分化标志物,其表达具有平滑肌组织特异性和细胞表型特异性.血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化是动脉粥样硬化、高血压等血管重塑性疾病的共同病理生理过程.VSMC表型转化过程中平滑肌特异基因的表达变化和细胞骨架的重构是当前研究的热点问题之一.本文就SM22α的结构特征及其在VSMC中的作用机制进行综述.
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雌激素/雌激素受体α信号通路抑制血管平滑肌细胞SM22α的转录作用
目的 确定雌激素/雌激素受体α(ERα)信号通路对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)分化标志基因SM22α的转录调节作用.方法 利用组织块贴壁法分离获得大鼠VSMCs,采用PCR方法扩增获得大鼠SM22α,并插入到pGL3-Basic质粒中构建SM22α启动子荧光素酶报告基因质粒.分别在VSMCs和COS-7细胞中利用Luciferase检测雌二醇(E2)、ERα及Myoeardin对SM22α启动子转录活性的影响情况.结果 SM22α启动子荧光素酶报告基因质粒构建成功,E2、ERα可以抑制Myocardin对SM22α的转录活性.结论 E2/ERα信号通路可通过抑制Myocardin对SM22α的转录活性,从而促进VSMCs由分化型向增殖型转变.
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24-乙酰泽泻醇A对ox-LDL诱导大鼠VSMC表型转化的影响及其与ERK1/2通路的关系
目的 观察24-乙酰泽泻醇A(alisol A 24-acetate)对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化及其表型转化过程中合成基质金属蛋白酶9(MMP-9)能力的影响,并探讨与ERK1/2的相关性.方法 以酶消化法体外培养大鼠VSMC,ox-LDL(50 mg/L)进行诱导,24-乙酰泽泻醇A(10 mg/L)进行干预,免疫细胞化学染色观察VSMC收缩表型标记蛋白SM22α的变化;RT-PCR检测VSMC MMP-9 mRNA的表达及Western blot检测VSMC MMP-9和ERK、p-ERK蛋白表达的变化.结果 在ox-LDL诱导下,VSMC收缩表型标志蛋白SM22α的表达降低,细胞向合成型转化,促进MMP-9的合成,伴随着ERK1/2磷酸化水平升高(P＜0.05);在24-乙酰泽泻醇A的干预下,VSMC收缩表型标志蛋白SM22α的表达增加,细胞向收缩表型转化,伴随着MMP-9及p-ERK的表达下降(P＜0.05).结论 24-乙酰泽泻醇A能有效抑制VSMC表型转化和MMP-9的表达,其机制可能与抑制ERK1/2信号通路有关.
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腹主动脉瘤组织中SM22α与骨桥蛋白以及细胞骨架蛋白表达的改变
目的:探讨SM22α与骨桥蛋白(OPN)以及细胞骨架蛋白α-SMA,β-tubulin,desmin在腹主动脉瘤(AAA)组织中的表达改变.方法:采集正常人腹主动脉壁和AAA动脉壁组织,分别采用real-timePCR与免疫组织化学法检测两种组织中SM22α,OPN,α-SMA,β-tubulin和desmin的mRNA与蛋白表达水平.结果:与正常腹主动脉壁组织比较,AAA组织中的SM22α,α-SMA,β-tubulin和desmin的mRNA与蛋白水平均明显降低,且SM22α表达降低为明显,而OPN的mRNA与蛋白的表达明显升高(均P＜0.05).结论:在AAA组织中,SM22α与细胞骨架蛋白表达降低,OPN升高,这些改变与AAA的发生可能有密切关系.
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猪颈动脉支架植入术后PPAR-γ的表达变化及对血管平滑肌表型转化的影响
目的 探讨核转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPAR-γ)在猪颈动脉支架植入后的表达及对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)表型转化的影响.方法 小型猪12只,为3组:①正常对照组(4只)；②支架植入组(4只)；③罗格列酮(ROSI)治疗支架组(4只).应用血管造影观察血管形态；应用免疫组织化学方法观察支架段血管病理组织形态及PPAR-γ的表达；Western blot检测支架段血管中PPAR-γ平滑肌22α(smooth muscle 22 alpha,SM22α)蛋白的表达并分析其与血管重构过程中VSMC表型转化的关系.结果 ①血管造影显示3个月后支架植入组狭窄程度较ROSI治疗支架组显著[分别为(1.46±0.14)、(0.91±0.13)mm,(P＜0.05)].②HE染色结果发现支架植入组血管内膜平滑肌增生较ROSI治疗支架组明显；免疫组化示支架植入组血管中PPAR-γ的表达评分较正常对照组、ROSI治疗支架组低[分别为(0.90 ±0.22)、(5.85 ±0.29)、(5.04±0.46),P＜0.05,ROSI治疗支架组与正常对照组间PPAR-γ表达无显著差异(P＞0.05)].③Western blot检测结果显示:支架植入组PPAR-γ/SM22α的表达水平值低于正常对照组[分别为(3.12±1.42)％/(16.72 ±5.34)％、(19.87±5.33)％/(68.85 ±9.73)％,P＜0.05],VSMC表型由收缩型向合成型转化；ROSI治疗支架组PPAR-γ/SM22α的表达[(23.17±4.23)％/(58.63±12.81)％]高于支架植入组(P＜0.05),VSMC表型由合成型向收缩型转化；ROSI治疗支架组PPAR-γ/SM22α表达水平与正常对照组相比无显著差异(P＞0.05).结论 PPAR-γ参与了支架植入术后VSMC表型转化过程,PPAR-γ可能是治疗支架植入术后再狭窄的潜在靶点之一.
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哈萨克族食管鳞癌组织中 SM22α的表达及其临床意义
目的：探讨哈萨克族食管鳞癌组织中 SM22α的表达情况及其临床意义。方法用免疫组织化学技术对筛选出的食管鳞癌组织中的差异蛋白 SM22α进行验证，并结合临床病理参数对162例石蜡包埋食管鳞癌组织及50例食管黏膜正常组织中 SM22α表达情况进行分析。结果 SM22α在食管鳞癌组织中的阳性表达率（87．0％）高于食管正常黏膜组织（36．0％），差异有统计学意义（P ＜0．05）；浸润深度（χ2＝8．078，P ＝0．044）、淋巴结是否转移（χ2＝6．420，P ＝0．012）与 SM22α在食管鳞状细胞癌肿瘤组织中阳性表达存在相关性（P ＜0．05）。结论SM22α可能参与了食管鳞状细胞癌的发生、发展。
