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乙酰葛根素对阿尔茨海默病大鼠蛋白激酶C-δ及白细胞介素-6表达的影响
目的 研究乙酰葛根素对β-淀粉样肽1-42(Aβ1-42)海马立体定位注射所致阿尔茨海默病(AD)模型大鼠的药物作用和对炎症因子蛋白激酶C-δ(PKC-δ)、白细胞介素-6(IL-6)表达的影响.方法 将40只Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、乙酰葛根素低、高剂量组.用Aβ1-42双侧海马注射制备AD大鼠模型,Morris水迷宫测定不同时期各组大鼠的学习记忆能力,ELISA测定血清IL-6含量的变化,Western blotting测定PKC-δ表达的变化.结果 模型大鼠应用Aβ1-42注射14d后,Morris水迷宫逃避潜伏期与术前及对照组比较显著延长,穿越平台次数显著减少(P＜0.01)；应用乙酰葛根素10d后,血清中IL-6的表达量模型组显著高于对照组、乙酰葛根素低、高剂量组(P＜0.01)；海马匀浆中PKC-δ的表达量模型组显著高于对照组、乙酰葛根素低、高剂量组,乙酰葛根素低、高剂量组表达仍高于对照组(P＜0.05).结论 乙酰葛根素能显著改善阿尔茨海默病模型大鼠的学习记忆能力,对阿尔茨海默病有显著的预防和保护作用,机制可能与调控PKC-δ/Caspase通路,抑制β-淀粉样肽的神经毒性,降低PKC-δ、IL-6的表达,从而发挥抗痴呆的作用.
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游离脂肪酸对肝脏氧化应激及胰岛素抵抗的影响
目的: 研究游离脂肪酸(FFA)慢性升高对肝脏胰岛素抵抗的影响, 探讨氧化应激在其中的作用.方法: 给Wistar大鼠分别静脉输注脂肪乳加肝素(IH组)和单纯输注生理盐水(SAL组)48 h, 在输注的后2 h, 清醒状态下行高胰岛素-正血糖钳夹试验, 观察延时输注脂肪乳导致的高FFA对葡萄糖利用率(葡萄糖输注率, GIR)的影响, 并取肝组织测定羰基蛋白、肝细胞膜和细胞质PKC-δ的含量.结果: 在高胰岛素-正血糖钳夹状态, IH输注组与SAL组比较, 血清FFA增加4.3倍(P <0.001),羰基蛋白增加3.2倍, GIR下降5 8 .6%(均P <0.001);48 h的IH输注使肝细胞膜的PKC-δ/胞质PKC-δ比值增加4.0倍(P <0.001).结论: FFA慢性升高导致了肝脏GIR下降, 葡萄糖的利用障碍, 肝脏的PKC-δ向细胞膜转位增加, 说明在慢性高FFA导致的肝脏胰岛素抵抗中, 氧化应激反应起了重要的作用.
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蛋白激酶C-δ:防治糖尿病血管并发症的新靶点
糖尿病并发症是糖尿病患者致死致残的主要原因,其病理生理机制中涉及蛋白激酶C(PKC)信号途径的激活.PKC-δ亚型的激活及其产生的后续效应参与了糖尿病大血管及微血管病变的发生发展.在细胞凋亡、增殖迁移及调节血管功能相关的细胞因子及细胞外基质方面,PKC-δ起到关键作用.故开发针对PKC-δ的特异性药物具有很大的前景.
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PKC-δ在TRAIL与阿霉素联合诱导骨肉瘤细胞株MG-63凋亡中的作用
目的 初步观察肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)与低剂量阿霉素(ADM)联合应用对人骨肉瘤细胞株MG-63细胞凋亡的影响,探讨蛋白激酶C-δ (PKC-δ)在其中的作用,并用PKC激活剂佛波脂(PMA)和PKC-δ特异性抑制剂Rottlerin对这一凋亡过程的影响来探讨PKC-δ在其中的作用.方法 倒置相差显微镜观察TRAIL与ADM联合应用后MG-63细胞凋亡形态的变化,同时逆转录-聚合酶链反应法检测PKC-δ的mRNA表达变化.流式细胞仪(FCM)检测PMA和Rottlerin作用联合组细胞后凋亡率的变化.结果 5μg/ml的ADM与500ng/ml的TRAIL联合作用24h后,部分MG-63细胞变圆、悬浮,可见大小不等的细胞碎片.TRAIL和ADM联合应用组PKC-δ的mRNA的表达明显增加,与单用组和对照组有显著性差异(P＜0.01).Rottlerin与联合用药作用12h后细胞的凋亡率降低,PMA则能使凋亡率增加(P＜0.01).结论 TRAIL与低剂量ADM联合作用可以促进MG-63细胞凋亡.Rottlerin能抑制TRAIL和ADM联合诱导MG-63细胞凋亡,PMA则起促进作用,PKC-δ可能参与了该凋亡过程并起促进作用.
关键词： 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 阿霉素 蛋白激酶C-δ 骨肉瘤 凋亡 -
蛋白激酶C-δ在舌鳞癌中的表达及对热杀伤舌鳞癌细胞的影响
目的:探讨PKC-δ在舌鳞癌中的表达特征及对热杀伤舌鳞癌细胞的影响.方法:应用En vision免疫组织化学法检测42例舌鳞癌肿瘤上皮细胞中PKC-δ蛋白的表达,以15例正常舌黏膜上皮为对照.每片随机观察5个高倍视野,计算阳性细胞数和上皮细胞总数之比,≥10%为PKC-δ(+)结果,＜10%为PKC-δ(-)结果.运用pcD-NA3.1(空载质粒)、野生型PKC-δ质粒转染舌鳞癌Tea8113细胞24小时,免疫印迹分析靶细胞中的PKC-δ表达;再43℃水浴热处理转染的靶细胞Omin、40min,常规培养24小时后流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果:15例对照组黏膜上皮细胞中可见PKC-δ阳性表达的细胞,阳性细胞率皆≥10%.为PKC-δ(+);42例舌鳞癌肿瘤细胞中28例为PKC-δ(-),14例为PKC-δ(+).经统计学分析正常舌黏膜组织中上皮细胞与舌鳞癌组织中肿瘤细胞PKC-δ(+)率在统计学上有显著性差异(P＜0.01);肿瘤细胞中PKC-δ的表达与病理分级无明显相关性(P＞0.05).PKC-δ在转染野生型PKC-δ质粒的Tca8113细胞中表达明显比转染pcDNA3.1的Tca8113细胞中表达增强;经统计学分析未加热(Omin)的两种靶细胞凋亡率无差异(P＞0.05),热处40min后两种靶细胞凋亡率有显著性差异(P＜0.01).结论:舌鳞癌组织中促进肿瘤细胞凋亡的PKC-δ存在缺失或低表达,PKC-δ可增加舌鳞癌肿瘤细胞对热诱导凋亡的敏感性.
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蛋白激酶C-δ在不同发育阶段小鼠睾丸的表达
目的观察蛋白激酶C-δ (PKC-δ)在不同周龄小鼠睾丸中的表达情况,探讨此种PKC同工酶在精子发生中的作用.方法采用出生后不同周龄的小鼠睾丸组织,进行SP免疫组织化学染色.结果 PKC-δ在生后睾丸组织中从无到有,生后第三周小鼠睾丸中微弱表达,第五周开始出现明显的表达量的增加,直到第12周.PKC-δ阳性细胞存在于曲细精管中心部位.结论 PKC-δ蛋白选择性表达于精子细胞中,并且呈现出独特的发育阶段性,说明在精子形成过程中这种PKC同工酶具有特殊的作用.
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蛋白激酶C-δ在Dectin-1-Src-Syk介导的巨噬细胞杀灭白假丝酵母菌中的作用研究
目的：研究蛋白激酶C-δ在Dectin-1-Src-Syk介导的巨噬细胞杀灭白假丝酵母菌中的作用，探讨固有免疫抗真菌的分子机制。方法：用流式细胞术检测细胞表面受体；用蛋白酶抑制剂预处理体外培养的小鼠巨噬细胞，通过Western blot分析相关蛋白的表达及磷酸化水平，并利用luminol法、荧光标记法和培养法检测巨噬细胞在白假丝酵母菌的刺激下释放活性氧分子、吞噬并杀灭真菌细胞的能力。结果：Dectin-1封闭剂与Src或Syk抑制剂均能抑制白假丝酵母菌诱导的PKC-δ磷酸化；蛋白激酶C-δ抑制剂Rottlerin对巨噬细胞吞噬白假丝酵母菌无显著影响；Rottlerin抑制白假丝酵母菌诱导的巨噬细胞p40phox磷酸化、活性氧分子的产生和对白假丝酵母菌的杀灭作用。结论：蛋白激酶C-δ抑制剂Rottlerin通过抑制巨噬细胞NADPH氧化酶复合物的活化和活性氧分子的释放降低对真菌细胞的杀灭作用，提示PKC-δ在固有免疫抗真菌中发挥重要的作用。
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不同血液透析液对U937细胞凋亡和PKCδ表达的影响
目的 研究不同血液透析液对U937细胞蛋白激酶C-δ(PKCδ)表达及细胞凋亡的影响.方法 在对数生长期人单核细胞株U937细胞培养液中添加不同血液透析液进行干预,分为A液+B液组(血液透析液A液+B液组合)、A液+B液+PKCδ特异性抑制剂(rottlerin)组、A液+B粉组(血液透析液A液+B粉组合)、A液+B粉+ rottlerin组,同时设立空白对照和正常对照组.分组干预后24 h和48 h分别收集细胞,Hoechst33258染色后荧光显微镜观察细胞形态学改变;Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡;RT-PCR和Western blotting 检测PKCδ mRNA和蛋白表达.结果 A液+B粉组凋亡细胞明显增多,呈凋亡典型形态学改变,分组干预24 h和48 h的细胞凋亡率明显高于相应时间点空白对照组、正常对照组和A液+B粉+rottlerin组(P<0.05);同时与两对照组和A液+B粉+rottlerin组比较,A液+B粉组U937细胞PKCδ mRNA和蛋白表达均明显上调(P<0.05).A液+B液组细胞凋亡率及PKCδ mRNA和蛋白表达与两对照组和A液+B液+rottlerin组比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 血液透析液A液+B粉组合对U937细胞有明显促凋亡作用,其机制可能与上调细胞PKCδ表达有关;与A液+B粉组合比较,选择A液+B液组合作为血液透析液可降低患者外周血单核细胞的细胞凋亡率.
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肺癌中蛋白激酶C-α、βⅡ及δ的表达及意义
目的检测PKC-α、-βⅡ、-δ在肺癌中的表达以探讨其与肺癌发生、发展的关系.方法采用免疫组化SP法分别检测84例肺癌原发灶及30例非小细胞肺癌淋巴结转移灶中PKC-α、-βⅡ、-δ的表达,分析其在肺癌的不同组织类型、不同分化程度以及原发灶与淋巴结转移灶之间表达的差异及意义.结果 PKC-α、-βⅡ与-δ在84例肺癌的阳性率分别为61.9%、70.2%和66.7%,在不同肺癌组织类型之间差异无显著性.PKC-α阳性率在小细胞癌(SCLC,58.3%)与非小细胞肺癌(NSCLC,62.5%)及其高中分化组(70.2%)与低分化组(48.0%)之间差异无显著性.PKC-βⅡ阳性率在SCLC(41.7%)与NSCLC(75.0%)及其高中分化组(74.5%)之间差异有显著性,在SCLC与低分化组(48.0%)之间差异无显著性.PKC-δ阳性率在SCLC(41.7%)与NSCLC(70.8%)及其高中分化组(78.7%)之间差异有显著性,在SCLC与低分化组(56.0%)之间差异无显著性.比较PKC-α、-βⅡ与-δ在30例淋巴结转移NSCLC的原发灶与转移灶的表达,3组阳性率差异无显著性.结论 PKC-α、-βⅡ与-δ的异常激活,在肺癌发生、发展过程中起重要作用.但3种亚型的作用各有不同, PKC-βⅡ可能是促进癌前病变的增生;PKC-α过表达与PKC-δ表达降低促进癌细胞增殖与凋亡减少,而癌分化降低、恶性程度增加.
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抑制剂Rottlerin对巨噬细胞在结核分枝杆菌刺激下NO和TNF分泌的影响
目的 研究蛋白激酶C-δ在巨噬细胞识别结核分枝杆菌后产生免疫应答过程中的作用,探讨固有免疫抗结核的分子机制.方法 用蛋白酶抑制剂预处理体外培养的小鼠巨噬细胞,通过Western Blot分析相关蛋白的表达及磷酸化水平,利用Griess法和ELISA方法检测巨噬细胞在结核分枝杆菌索状因子合成类似物TDB的刺激下释放一氧化氮(NO)和分泌肿瘤坏死因子(TNF)的水平.结果 Syk抑制剂Piceatannol能抑制TDB诱导的PKC-δ磷酸化;经过蛋白激酶C-δ抑制剂Rottlerin的处理,巨噬细胞受TDB诱导释放的NO浓度由对照组的30 μM降至5μM,分泌的TNF浓度为对照组的10％.结论 蛋白激酶C-δ抑制剂Rottlerin抑制TDB诱导的巨噬细胞释放NO和分泌TNF,提示PKC-δ在抗结核固有免疫中发挥重要的作用.
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磷酸化 PKC-δ对地塞米松诱导大鼠成骨细胞凋亡的影响
目的：观察磷酸化PKC-δ对地塞米松（ Dex）诱导的大鼠成骨细胞凋亡的影响。方法取新生SD大鼠颅骨第3代成骨细胞，分为对照组、Dex组（1×10－7 mol／L Dex）、PMA预处理组（1×10－7 mol／L Dex＋100 nmol／L PMA）、Rottlerin预处理组（1×10－7 mol／L Dex＋2μmol／L Rottlerin），培养24 h后采用MTT法检测细胞增殖活性，采用Annexin-V-FITC／PI染色流式细胞术和吖啶橙／溴乙锭（ AO／EB）荧光染色法检测细胞凋亡，采用Western blot-ting法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3及磷酸化PKC-δ。结果与对照组相比，Dex组细胞增殖活性低，细胞凋亡多，磷酸化PKC-δ、Caspase-3、Bax表达高，Bcl-2表达低（ P均＜0．05）。与Dex组相比，PMA预处理组细胞增殖活性低，细胞凋亡多，磷酸化PKC-δ、Caspase-3、Bax表达高，Bcl-2表达低（P均＜0．05）。与Dex组相比，Rottlerin预处理组细胞增殖活性高，细胞凋亡少，磷酸化PKC-δ、Caspase-3、Bax表达低，Bcl-2表达高（P均＜0．05）。结论磷酸化PKC-δ可促进Dex诱导的大鼠成骨细胞凋亡。
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蛋白激酶C-δ抑制剂Rottlerin抑制造影剂诱导的肾小管上皮细胞凋亡
目的:研究蛋白激酶C-δ(PKC-δ)抑制剂Rottlerin在造影剂诱导的肾小管上皮细胞凋亡中的作用及其机制。方法:体外培养的大鼠肾小管细胞(NRK-52E)分别与不同碘浓度(25，50，100，150 gI/L)的碘帕醇（非离子型造影剂）共孵育2 h；或者以100 gI/L碘帕醇先后处理NRK-52E细胞0.5，1，2，4h,相同渗透浓度(420 mOsm/kg)的甘露醇处理4h作为对照；部分细胞用2μmol/L Rottlerin与100 gI/L碘帕醇共同处理2h。Hoechst 33342染色检测凋亡细胞核形态并计算凋亡细胞百分比；并以DEVD-AFC为底物，用荧光酶标仪测量Caspase-3酶活性；用DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧产物(ROS)水平；用Western blot检测PKC-δ蛋白表达和磷酸化。结果:碘帕醇与NRK-52E细胞共孵育后，细胞内PKC-δ蛋白表达和Tyr-311位点磷酸化增加，细胞内ROS产生增加，Caspase酶活性上升。碘帕醇呈浓度和时间依赖性诱导NRK-52E细胞凋亡。Rottlerin可明显抑制以上变化。结论:PKC-δ抑制剂Rottlerin通过抑制PKC-δ活化和细胞内氧化应激抑制碘帕醇诱导的NRK-52E细胞凋亡，为造影剂肾病的预防和治疗提供了新靶点和新药物。
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护肝清脂片药物血清对非酒精性脂肪肝细胞模型内质网应激的影响
目的 探讨护肝清脂片药物血清对混合脂肪酸诱导的非酒精性脂肪肝HepG2细胞模型内质网应激(ER stress)的影响及其可能机制.方法 油酸和棕榈酸以2:1比例混合制备成1 mmol/L游离脂肪酸(FFA)混合液,诱导HepG2细胞24 h发生脂肪变性,建立NAFLD体外模型,将HepG2细胞分为对照组(CON)、FFA组、护肝清脂片低剂量组(HG-L)、护肝清脂片中剂量组(HG-M)、护肝清脂片高剂量组(HG-H)及非诺贝特阳性对照组(FF),在加入1 mmol/L FFA前分别加入各组对应的药物血清作用24 h,CON组及FFA组则加入大鼠空白血清作为对照.油红O染色观察细胞内脂滴分布;试剂盒检测细胞内甘油三酯(TG)含量及培养上清液谷草转氨酶(AST/GOT)、谷丙转氨酶(ALT/GPT)的水平;透射电镜观察细胞内质网形态结构的改变;Western blot、qRT-PCR技术检测ERS相关信号分子GRP78、PERK、p-PERK、ATF6、ATF4、XBP-1、CASPASE-12、CHOP、PKC-δ、p-PKC-δ蛋白及(或)mRNA的表达情况.利用siRNA瞬时转染技术沉默PKC-δ在HepG2细胞中的表达后观察GRP78、PERK、p-PERK、CASPASE-12和CHOP蛋白表达变化.结果 与CON组相比,FF组HepG2细胞油红染色可见红色脂滴密布细胞质,TG、AST、ALT含量升高(P<0.001);与FF组相比,HG-L、HG-M、HG-H及FF均在不同程度上降低TG、AST、ALT含量,减少细胞内脂滴堆积,差异有统计学意义(P<0.05),并能够在蛋白及mRNA水平上有效地下调ERS相关信号分子GRP78、p-PERK、ATF6、ATF4、CHOP、CASPASE-12、XBP-1、PKC-δ、p-PKC-δ的表达,差异有统计学意义(P<0.05).在1 mmol/L FFA共同作用下,PKC-δsiRNA转染组GRP78、p-PERK、CHOP、CASPASE-12蛋白表达均较对照组明显下调,差异具有统计学意义(P<0.001).然而,与PKC-δsiRNA+FFA组相比,PKC-δsiRNA+HG-H组GRP78和P-PERK表达下调更显著(P<0.001,0.01),CHOP和CASPASE-12则无统计学差异(P>0.05).结论 护肝清脂片药物血清可以有效地防治混合脂肪酸诱导的NAFLD细胞模型脂肪变性,改善HepG2功能状态,有效地缓解1 mmol/L游离脂肪酸所致的内质网应激,其作用机制在一定程度上与下调PKC-δ表达有关.
