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益气解毒方对鼻咽癌细胞标志物T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1及Ras相关C3肉毒素底物1表达的影响
目的 观察益气解毒方对鼻咽癌细胞标志物T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1 (Tiam1)和Ras相关C3肉毒素底物1 (Rac1)表达的影响,探讨其作用机制.方法 实验分为对照组、益气解毒方组和阳性药组,分别予生理盐水、益气解毒方药液和5-氟尿嘧啶注射液,干预后置于37℃、5％CO2孵育箱中培养,24 h后采集细胞.免疫组化和Western blot检测细胞Tiam1和Rac1蛋白表达,RT-PCR检测细胞Tiam1和Rac1 mRNA表达.结果 与对照组比较,益气解毒方组和阳性药组Tiam1和Rac1的蛋白和mRNA表达明显降低,且益气解毒方组降低更明显(P＜0.01).结论 益气解毒方可能通过抑制肿瘤细胞标志物Tiam1和Rac1的表达,达到治疗鼻咽癌的作用.
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Rac1/MAPK/ERK通路在大鼠呼吸机相关性肺损伤中的作用及机制
目的 探讨Ras相关C3肉毒素底物1/丝裂素活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(Rac1/MAPK/ERK)信号通路在大鼠呼吸机相关性肺损伤(VILI)中的作用及其机制.方法 将30只SD大鼠按随机数字表法分为自主呼吸组、正常潮气量(VT)组和大VT组,每组10只.自主呼吸组大鼠保留自主呼吸;正常VT组和大VT组大鼠均行气管切开后气管插管,双肺分别给予6 mL/kg和40 mL/kg VT的机械通气并维持麻醉.通气4h后处死大鼠取心脏血、支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清和BALF中白细胞介素(IL-1β、IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、髓过氧化物酶(MPO)及巨噬细胞炎症因子-2(MIP-2)水平.测定肺组织湿/干重比值(W/D);苏木素-伊红(HE)染色后,光镜下观察肺组织病理学改变,并进行病理学评分;透射电镜下观察Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)超微结构改变;采用免疫组化法检测肺组织磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)阳性表达,采用免疫荧光技术检测肺组织Rac1和F-肌动蛋白(F-actin)的阳性表达;采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测肺组织ERK及Rac1的mRNA表达;采用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测肺组织Rac1、p-ERK及F-actin的蛋白表达.结果 ①与自主呼吸组比较,机械通气两组肺W/D比值均明显升高,以大VT组升高更为显著(6.64±0.88比1.79± 0.36,P＜ 0.01).②自主呼吸组肺组织及AECⅡ超微结构无明显病理学改变.正常VT组肺组织有轻微水肿及少量炎性细胞浸润;AECⅡ板层小体较少,细胞膜绒毛分布欠均匀.大VT组肺组织明显水肿,肺间隔增宽,肺泡充血,伴有大量炎性细胞浸润,肺泡结构紊乱;AECⅡ形态不规则,核固缩明显,胞质中板层小体数量减少且分布不均.大VT组肺组织病理学评分明显高于自主呼吸组和正常VT组(分:12.00±2.00比6.00± 1.51、8.50± 0.93,均P＜0.01).③与自主呼吸组比较,机械通气两组血清及BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α、MPO、MIP-2水平均明显升高,以大VT组升高更为显著[血清IL-1β(ng/L):104.2±15.1比20.3±8.3,IL-6 (ng/L):46.6±11.5比22.7±7.5,TNF-α (ng/L):39.4±6.5比5.4±1.9,MPO (ng/L):0.66±0.24比0.06±0.03,MIP-2(ng/L):109.2±25.8比22.8±8.4;BALF中IL-1β(rng/L):121.5±25.6比24.0±7.5,IL-6 (ng/L):136.7±32.7比31.4±10.5,TNF-α(ng/L):98.0± 14.8比10.1 ±2.6,MPO(ng/L):0.80±0.31比0.08±0.04.MIP-2(ng/L):144.4± 28.9比41.2±20.7;均P＜0.01].④自主呼吸组仅有极少量p-ERK、Rac1和F-actin阳性表达;正常VT组阳性表达有所增加;大VT组p-ERK阳性表达明显增加,Rac1、F-actin分别分布于细胞膜和细胞质,阳性表达进一步增强.⑤大VT组ERK、Rac1基因和p-ERK、Rac1、F-actin蛋白表达量明显高于自主呼吸组和正常VT组[ERK mRNA (2-T△△ct):8.23±2.83比1、3.02± 1.38,p-ERK蛋白(灰度值):1.15±0.36比0.61±0.23、0.88±0.22;Rac1 mRNA (2-△△Ct):4.45±2.26比1、1.22±0.39,Rac1蛋白(灰度值):0.91 ±0.16比0.48±0.11、0.55 ±0.10;F-actin蛋白(灰度值):0.70±0.09比0.49±0.08、0.55±0.04;均P＜0.01].结论 VILI模型大鼠肺组织F-actin表达明显上调,AECⅡ骨架重构和细胞膜通透性改变,推测F-actin可能通过激活Rac1/MAPK/ERK信号通路加重VILI.
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Numb对结肠癌细胞迁移和侵袭的影响
目的:探讨Numb基因对结肠癌细胞迁移和侵袭的影响及其可能的作用机制.方法:应用蛋白质印迹法检测结肠上皮细胞HCEpi及结肠癌SW480、SW620和HCT-8细胞中Numb蛋白的表达.将含Numb过表达重组载体的慢病毒感染Numb表达水平较低的HCT-8细胞(HCT-8-Numb组),应用蛋白质印迹法检测空白对照组(HCT-8细胞未进行感染)、阴性对照组(HCT-8细胞感染含空载体的慢病毒)和HCT-8-Numb组HCT-8细胞中Numb蛋白的表达水平,并应用蛋白质印迹法、细胞划痕实验和Transwell法检测空白对照组、阴性对照组、HCT-8-Numb组和Ras相关C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1)抑制剂NSC23766处理组HCT-8细胞中活化的Rac1蛋白的表达水平以及细胞迁移和侵袭能力.结果:结肠上皮细胞HCEpi中Numb蛋白的表达水平明显高于结肠癌SW480、SW620和HCT-8细胞(P值均＜0.05),且HCT-8细胞中Numb蛋白的表达水平低.HCT-8-Numb组细胞中Numb蛋白的表达水平明显高于空白对照组和阴性对照组(P值均＜ 0.05).HCT-8-Numb组细胞中活化的Rac1蛋白的表达水平明显低于空白对照组和阴性对照组(P值均＜ 0.05),而与NSC23766处理组细胞中活化的Rac1蛋白的表达水平相比差异无统计学意义(P＞0.05).HCT-8-Numb组细胞的迁移和侵袭能力明显低于空白对照组和阴性对照组(P值均＜ 0.05),而与NSC23766处理组细胞的迁移和侵袭能力相比差异无统计学意义(P＞0.05).结论:过表达Numb蛋白可抑制结肠癌HCT-8细胞的迁移和侵袭,这一作用可能与抑制Rac1蛋白的活化有关.
关键词： 结肠肿瘤 细胞运动 肿瘤浸润 Numb基因 Ras相关C3肉毒素底物1 -
小GTP酶Rac1对肺癌A549细胞凋亡和吞噬作用的影响
目的:分析肺癌A549细胞Rac1的表达水平及其对细胞吞噬功能的影响.方法:采用姜黄素诱导A549细胞凋亡;采用流式细胞术检测Rac1抑制剂对A549细胞凋亡的影响;将A549细胞与同系凋亡细胞共培养,应用荧光显微镜技术观察Rac1下调对A549细胞清除凋亡细胞能力的影响.用qRT-PCR检测细胞Rac1 mRNA表达水平.结果:流式双染和Hoechst染色荧光显微镜观察结果显示,Rac1抑制剂能够明显增强姜黄素诱导的A549细胞凋亡,凋亡细胞率相对于未加入Rac1抑制剂时显著上升,且呈现与Rac1抑制剂的剂量依赖特性.此外,Rac1抑制剂能明显下调A549细胞的吞噬能力.结论:Rac1可抑制肺癌A549细胞的凋亡,增强其吞噬功能.
关键词： 肺癌A549细胞 Ras相关C3肉毒素底物1 细胞凋亡 细胞吞噬 -
夹脊电针结合神经松动术对兔坐骨神经损伤后下肢运动功能的影响及其相关机制
目的 夹脊电针结合神经松动术对兔坐骨神经损伤后下肢运动功能以及Ras相关C3肉毒素底物1的mRNA和蛋白表达的影响.方法 采用随机数表法将180只新西兰家兔分为正常对照组、模型对照组、夹脊电针组、神经松动术组、夹脊电针结合神经松动术组.每组36只,再按取材时间点分为治疗1周、2周、4周后共3个亚组,每个亚组12只新西兰家兔.模型对照组、夹脊电针组、神经松动术组、夹脊电针结合神经松动术组均采用钳夹法造成坐骨神经损伤模型,正常对照组、模型对照组不做任何干预,神经松动术组行神经松动术治疗,夹脊电针组进行夹脊电针治疗,夹脊电针结合神经松动术组进行夹脊电针和神经松动术治疗.于治疗1、2、4周后采用趾张反射评分和改良的Tarlov评分评定5组大鼠新西兰家兔的下肢功能恢复情况.并于治疗1、2、4周后,每组均抽取12只新西兰家兔放血处死后取坐骨神经和相应节段脊髓(L4-L6段),采用聚合酶链反应(PCR)检测和免疫印迹(Western blot)检测Ras相关C3肉毒素底物1 mRNA及蛋白的表达.结果 治疗后1、2、4周后,夹脊电针组、神经松动术组和夹脊电针结合神经松动术组新西兰家兔的坐骨神经功能均优于模型对照组同时间点,但均弱于正常对照组同时间点,差异均有统计学意义(P<0.05);且夹脊电针结合神经松动术组各时间点的坐骨神经功能均优于夹脊电针组和神经松动术组同时间点,差异均有统计学意义(P<0.05).经PCR灰度分析,治疗1、2、4周后,夹脊电针结合神经松动术组节段脊髓和坐骨神经中Ras相关C3肉毒素底物1mRNA的表达量高于夹脊电针组和神经松动术组同时间点,差异均有统计学意义(P<0.01).经Western blot灰度分析,治疗1周后,夹脊电针结合神经松动术组节段脊髓Ras相关C3肉毒素底物1蛋白的表达量显著高于夹脊电针组,差异有统计学意义(P<0.01);治疗2、4周后,夹脊电针结合神经松动术组节段脊髓Ras相关C3肉毒素底物1蛋白的表达量显著高于夹脊电针组和神经松动术组同时间点,差异均有统计学意义(P<0.01).经Western blot灰度分析,治疗2、4周后,夹脊电针结合神经松动术组坐骨神经中Ras相关C3肉毒素底物1蛋白的表达量显著高于夹脊电针组和神经松动术组同时间点,差异均有统计学意义(P<0.01).结论 神经松动术结合夹脊电针治疗可促进坐骨神经损伤后轴突再生的作用,其作用机制可能与上调损伤的坐骨神经和相应脊髓节段Ras相关C3肉毒素底物1基因以及蛋白的表达有关.
关键词： 坐骨神经损伤 夹脊电针 神经松动术 Ras相关C3肉毒素底物1 -
M3型乙酰胆碱受体对心脏成纤维细胞α-平滑肌肌动蛋白的表达及机制
目的 探讨M3型乙酰胆碱受体(M3R)对心脏成纤维细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达影响及其机制.方法 体外分离培养大鼠心脏成纤维细胞,Western blot法测定α-SMA、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38)、磷酸化p38(p-p38)和Ras相关C3肉毒素底物1(Rac1)的表达;谷胱甘肽巯基转移酶沉淀实验(GST Pull-down)法检测Rac1的活性.结果 乙酰胆碱(1.0×10-7、1.0×10-6、1.0×10-5 mol/L,2h)呈浓度依赖性促进α-SMA的表达上调(P＜0.05),M3R特异性阻断剂4-二苯乙酰氧基-N-甲基-哌啶(4-DAMP)抑制乙酰胆碱(Ach)介导的α-SMA表达上调(1.432±0.093比2.534±0.241,P＜0.05);M3R促进p-p38表达上调(171％,P＜0.05),p38特异性抑制剂SB203580抑制M3R介导的α-SMA表达上调(1.614±0.128比2.873±0.193,P＜0.05);M3R活化Rac1(182％,P＜0.05),Rac1特异性抑制剂NSC23766抑制M3R介导的p-p38表达上调(1.301±0.154比1.821±0.113,P＜0.05).结论M3R通过激活Rac1-p38信号通路促进心脏成纤维细胞α-SMA的表达.
