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组蛋白去甲基化酶JARID1B的表达纯化及酶活力分析
目的 筛选能够大量表达、方便纯化且具有酶活性的组蛋白去甲基化酶JARID1B(jumonji AT-rich interactive domain 1B)的截短体.方法 通过Bac-to-Bac系统制备含目的基因的杆粒(bacmid),转染Sf9昆虫细胞获得重组病毒基因组,并感染Hi5昆虫细胞表达目的蛋白,用Ni-NTA亲和层析,离子交换层析和分子筛纯化目的蛋白.利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometer,MALDI-TOF)分析截短体的酶活力.结果 去除C-端两个PHD结构域的截短体JARID1B1-825能够在昆虫细胞Hi5中得以大量表达(1L细胞含10 mg蛋白),经Ni-NTA亲和层析,阴离子交换层析和分子筛三步纯化,获得纯度大于90％的目的蛋白,MALDI-TOF质谱分析显示JARID1B1-825仍拥有去组蛋白甲基化修饰的酶活性.结论 筛选到了能够大量表达、方便纯化且具有酶活性的JARID1B的截短体,对其后续的功能研究和药物开发具有重要的意义.
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组蛋白去甲基化酶JMJD3对骨髓基质干细胞干性特征及体外成骨分化的影响
目的：探讨组蛋白去甲基化酶JMJD3对骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）体外多潜能性及成骨分化的生物学调控作用。方法：用离心和贴壁培养相结合方法分离培养大鼠四肢骨BMSCs，分别用含JMJD3-shRNA的绿色荧光蛋白（GFP）慢病毒干扰载体（实验组）及含无关序列的GFP慢病毒载体（对照组）转染BMSCs，Western blot方法检测两组BMSCs中组蛋白H3第27位赖氨酸上三甲基化（H3K27me3）及干细胞多潜能转录因子Oct4、Nanog、Sox2的表达，并比较两组细胞的克隆形成率；实时定量RT-PCR、Western blot、茜素红染色检测两组细胞的体外成骨分化能力。结果：与对照组相比，实验组BMSCs的H3K27me3表达水平升高，具有更强的克隆形成能力，且表达更强的Oct4、Nanog、Sox2等多潜能因子；体外成骨诱导7 d后，实验组BMSCs中RUNX2等成骨分化基因表达下降，诱导14 d后，钙结节形成较对照组少。结论：抑制JMJD3表达可增强BMSCs的干性特征，抑制其成骨分化。
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Jmjd3基因RNAi慢病毒载体构建及转染BMSCs效应的实验研究
目的 构建针对SD大鼠Jmjd3基因RNAi慢病毒载体,转染大鼠骨髓间充质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs) 后观察其对Jmjd3基因的抑制作用并筛选有效干扰序列.方法 设计4对Jmjd3基因shRNA寡核苷酸序列,插入pGCSIL - GFP载体形成重组载体.重组载体经过测序鉴定后转染293T细胞生产病毒液,病毒液转染大鼠BMSCs,Western blot分析转染前后Jmjd3表达情况.通过计算Jmjd3灰度值/ACTIN灰度值,筛选出有效的干扰序列.结果 测序结果证实Jmjd3基因shRNA寡核苷酸序列正确插入载体中,成功构建4个大鼠Jmjd3基因RNAi表达载体.Western blot检测显示转染后Jmjd3 蛋白表达显著下调,半定量分析显示相对于未转染组,shRNA -1组、shRNA -2组、shRNA -3组、shRNA -4组分别下调79.5％ (P ＜0.001)、90.7％ (P ＜0.001)、73.7％ (P ＜0.001)、56.5％ (P ＜0.001),而GFP组下调11.5％ (P ＞0.05),shRNA -2组为佳干扰序列.结论 针对大鼠Jmjd3基因RNAi慢病毒载体构建成功,并能有效抑制BMSCs中Jmjd3基因的表达.
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组蛋白去甲基化酶JMJD1A及其生物学功能研究进展
组蛋白去甲基化酶JMJD1A(Jumonji domain containing 1A)通过羟基化作用使组蛋白赖氨酸去甲基而参与转录调节,参与精子生成、能量代谢、干细胞调控,与肿瘤的发生和发展相关,是潜在的抗肿瘤药物的作用靶点.本文就JMJD1A的结构、催化反应机理、底物特异性、生物学功能和抑制剂作一综述.
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十字形结构域蛋白2C 在肿瘤中的研究进展
赖氨酸甲基化是调控染色体结构的组蛋白后修饰中的一种。在肿瘤的形成过程中可观察到其修饰状态的改变,这可能是组蛋白赖氨酸甲基转移酶或去甲基化酶作用的结果。十字形结构域蛋白2C(JMJD2C)是组蛋白去甲基化酶(JMJD2)家族的重要成员之一,包含有一个具有催化组蛋白赖氨酸去甲基化作用的 JmjC 结构域,同时其还具有诱导基因型改变、调控基因表达及介导蛋白质间相互作用等重要功能。近年研究显示,JMJD2C 基因在食管癌、前列腺癌和乳腺癌等多种恶性肿瘤中高表达,剔除 JMJD2C 基因等,可以减慢多种肿瘤细胞的生长。因此,JMJD2C 为一潜在致癌基因,并可能成为肿瘤治疗新的靶点。
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绝经后骨质疏松症患者骨组织 JMJD2A、JMJD2B 表达变化及意义
目的：观察绝经后骨质疏松症（ PMOP）患者骨组织组蛋白去甲基化酶JMJD2表达变化，并分析其与骨密度（BMD）的关系。方法选择拟行全髋关节置换术的绝经后患者30例，术前根据股骨颈BMD分为骨质疏松组15例和骨量正常组15例。术中取术侧股骨颈松质骨，采用实时定量PCR法和免疫组化法分别检测骨组织中JM-JD2A和JMJD2B mRNA和蛋白表达，并分析其与BMD的关系。结果与骨量正常组比较，骨质疏松组JMJD2A、JMJD2B mRNA相对表达量和蛋白阳性率均显著降低（P均＜0．01）。直线相关分析结果显示，BMD与JMJD2A、JM-JD2B mRNA相对表达量均呈正相关（r分别为0．705，0．796，P均＜0．01）BMD与JMJD2A、JMJD2B蛋白表达阳性率均呈正相关（r分别为0．606、0．674，P均＜0．01）。结论 PMOP患者骨组织JMJD2A和JMJD2B表达均降低，二者可能共同参与了PMOP的发病过程。
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组蛋白甲基转移酶研究进展
研究表明组蛋白甲摹转移酶与异染色质的形成、基因的转录调控以及肿瘤形成密切相关.组蛋白甲基研究已成为表观遗传学的重要研究内容,是分子生物学、肿瘤学关注的热点.本文就组蛋白甲基转移酶与异染色质的形成、基因的转录调控、肿瘤的形成以及组蛋白去甲基化酶作一综述.
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罗勒多糖对肝癌细胞缺氧模型组蛋白去甲基化酶LSD1、JMJD2B及JARID1B表达的影响
目的 研究罗勒多糖对肝癌细胞MHCC97H和MHCC97L缺氧模型组蛋白去甲基化酶LSD1、JMJD2B及JARID1B表达的影响,探讨罗勒多糖抗肿瘤侵袭转移作用与表观遗传修饰的关系.方法 采用二氯化钴诱导肝癌细胞缺氧,建立肝癌细胞MHCC97H和MHCC97L体外缺氧模型,通过不同剂量罗勒多糖干预24h,细胞划痕实验检测缺氧条件下肝癌细胞的迁移能力,实时荧光定量PCR法检测各组肝癌细胞中HIF-1α、LSD1、JMJD2B及JARID1B mRNA表达水平,Western-blot法检测各组肝癌细胞中HIF-1α、LSD1、JMJD2B及JARID1B蛋白表达情况.结果 罗勒多糖能抑制缺氧条件下MH-CC97H和MHCC97L细胞的迁移能力,下调细胞中HIF-1α mRNA及蛋白的表达水平,与缺氧模型组相比有显著性差异(P＜0.05);罗勒多糖能够下调MHCC97H细胞缺氧条件下LSD1、JMJD2B、JARID1B mRNA和蛋白的表达,与缺氧模型组相比有显著性差异(P＜0.05);缺氧条件下MHCC97L细胞中LSD1、JMJD2B、JARID1B mRNA和蛋白的表达与正常对照组无显著性差别(P＞0.05),罗勒多糖对这三种酶的表达亦无显著作用.结论 罗勒多糖能改善不同转移潜能肝癌细胞MHCC97H和MHCC97L的缺氧微环境,抑制肿瘤细胞的侵袭转移.其中罗勒多糖对高转移潜能肝癌细胞MHCC97H的抗侵袭转移作用与其对细胞中组蛋白去甲基化酶LSD1、JMJD2B、JARID1B的调节有关,而对低转移潜能肝癌细胞MH-CC97L侵袭转移能力的调节未发现与LSD1、JMJD2B、JARID1B有明显关系.
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KDMs参与恶性肿瘤细胞上皮间质转化
转移是导致肿瘤患者预后差的根本原因。上皮间质转化（ epithehal?mesenchymal transition， EMT）是调控胚胎发生和组织发育过程中细胞形态和功能改变的复杂程序。 EMT在肿瘤转移过程中也起重要作用。已知表观遗传修饰在调控基因表达中起重要作用，其中包括组蛋白甲基化。组蛋白去甲基化酶（ his?tone demethylase）可通过特异性的作用于赖氨酸单甲基化、双甲基化和三甲基化调控基因表达。越来越多的研究表明组蛋白赖氨酸去甲基化酶（ histone lysine demethylases， KDMs）在调控MET相关基因表达中其重要作用。文章就KDMs在人类恶性肿瘤细胞的EMT过程中的研究进展作一综述。
关键词： 恶性肿瘤 上皮间质转化 表观遗传学 组蛋白去甲基化酶 组蛋白赖氨酸去甲基化酶 -
组蛋白甲基化修饰的研究进展
1组蛋白及其组蛋白密码在真核生物中,核小体是染色质的基本结构单位,是由DNA和组蛋白共同构成.组蛋白分子分为为H1、H2A、H2B、H3和H4等5种.核心组蛋白足由H2A、H2B、H3、H4各2个分子形成的八聚体,与其上缠绕的146 bp DNA双螺旋分子构成了核小体的核心颗粒,核小体的核心颗粒之间再由约60个碱基对DNA和组蛋白H1连接起来形成串珠样结构.组蛋白富含带正电荷的精氨酸和赖氨酸,可以与带有负电荷的DNA分子紧密结合.每个核心组蛋白由一个球形结构域和暴露在核小体表面的N端尾区组成,其N端氨基末端会发生多种共价修饰,包括磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化、糖基化、碳基化等,这些修饰可能通过2种机制影响染色体的结构与功能.
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维生素C促进根尖牙乳头间充质干细胞组蛋白去甲基化酶KDM2B和KDM5C表达的研究
目的:研究维生素C是否具有调节根尖牙乳头间充质干细胞组蛋白去甲基化酶相关基因表达的功能.方法:利用不同剂量的维生素C刺激人根尖牙乳头间充质干细胞;采用qRT-PCR(real time reverse transcription-polymerase chain reaction,实时定量RT-PCR)在mRNA水平检测组蛋白去甲基化酶相关基因的表达.结果:qRT-PCR结果显示组蛋白去甲基化酶KDM2B(Lysine (K)-specific demethylase 2B)和KDM5C (Lysine(K)-specific demethylase 5C)在10 μmol/L维生素C刺激后2、4和8h表达明显升高,其表达升高程度与维生素C的作用具有时依赖性;qRT-PCR结果显示与未刺激组相比,5、10和20ttmol/L维生素C在作用8h后都能促进KDM2B和KDM5C的表达,其表达升高程度与维生素C的作用具有剂量依赖性的关系.结论:在根尖牙乳头间充质干细胞中维生素C可以促进组蛋白去甲基化酶KDM2B和KDM5C的表达.
关键词： 维生素C 组蛋白去甲基化酶 根尖牙乳头间充质干细胞 KDM2B KDM5C -
脂多糖促进牙周膜间充质干细胞组蛋白去甲基化酶HR表达的研究
目的:脂多糖是否对牙周膜间充质干细胞(periodontal ligment stem cells,PDLSCs)中组蛋白去甲基化酶相关基因表达存在调控功能.方法:利用不同剂量的脂多糖对牙周膜干细胞进行刺激处理;在mRNA水平利用实时定量RT-PCR (real time reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测组蛋白去甲基化酶相关基因的表达.qRT-PCR结果显示HR(hairless homolog)基因在脂多糖刺激后24 h和48 h结果显示,能促进HR的表达,其表达升高的水平与脂多糖刺激时间有相关性.1、5和10 mg/L脂多糖在作用48 h后都能促进HR的表达,其表达升高的水平与脂多糖刺激剂量有相关性.10 μg/mL脂多糖抑制牙周膜干细胞体外矿化能力.结论:在牙周膜干细胞中脂多糖对牙周膜干细胞组蛋白去甲基化酶HR的表达有促进作用.
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组蛋白去甲基化酶在急性髓系白血病的研究进展
急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是发生于血液系统造血干/祖细胞的恶性增殖性疾病,主要由于遗传变化使髓细胞分化成熟障碍和凋亡受阻,导致其在骨髓中恶性增殖和积聚,从而影响正常的造血功能[1-2].目前的治疗方法主要是诱导分化的化学疗法,但却面临复发与耐药等问题.组蛋白的甲基化修饰是表观遗传学的调控机制之一,通过激活和抑制基因的转录而参与细胞的增殖、凋亡等.近年来研究发现,组蛋白的甲基化修饰在癌基因的激活和抑癌基因功能的缺失方面有着重要的作用.本文就组蛋白去甲基化酶的研究背景、组蛋白去甲基化酶与急性髓系白血病的研究进展进行简要阐述,并对组蛋白去甲基化酶的潜能进行了展望.
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2型糖尿病并大血管病变患者外周血LSD1的表达及意义
目的 探讨组蛋白去甲基化酶LSD1在2型糖尿病大血管病变发病中的作用.方法 随机选取10例2型糖尿病并大血管病变患者(DV组)和10例2型糖尿病无大血管病变患者(DM组),以10名健康志愿者作对照(NC组),分别用Western blot和共聚焦显微镜检测各组外周血中LSD1的蛋白表达,用RT-PCR检测各组LSD1和核因子kappa B(NF-κ B)的mRNA表达,并比较各组结果.结果 与正常对照NC组相比,DM组和DV组LSD1的蛋白和mRNA表达均降低(P＜0.05),且DV组较DM降低更明显(P＜005);与NC组相比,DM组和DV组的NF-κB表达均增高(P＜0.05),且DV组较DM增高更显著(P＜0.05).结论 去甲基化酶LSD1表达下调和2型糖尿病大血管病变可能存在相关性.
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组蛋白甲基化酶及去甲基化酶的研究进展
组蛋白修饰作为表观遗传中重要的调控机制之一,在包括基因表达调控等多种生物学过程中起着重要作用.组蛋白甲基转移酶和组蛋白去甲基化酶共同参与形成和维持不同的组蛋白甲基化状态,继而通过多种分子参与对组蛋白甲基化修饰的识别而引起下游过程的发生.本文拟从组蛋白甲基转移酶、组蛋白去甲基化酶等方面综述这一领域的研究进展.
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非组蛋白甲基化与肿瘤研究进展
大量研究表明组蛋白甲基转移酶与去甲基酶功能的异常在肿瘤发生中起到重要作用,针对这些酶的小分子抑制剂逐渐成为一类新的抗肿瘤药物.对这些酶的功能研究长期集中在对组蛋白的修饰方面,然而近年来越来越多的非组蛋白甲基化底物被发现,比如p53、Rb等,这些蛋白的甲基化对其功能的影响也越来越明确.本文总结一些与肿瘤发生相关的非组蛋白甲基化修饰的催化酶及其生物功能,讨论这些发现对相应甲基转移酶与去甲基酶抑制剂的开发和作用机制研究的重要意义.
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组蛋白去甲基化酶JMJD3对乳腺癌干细胞的影响
目的 探索组蛋白去甲基化酶JMJD3对乳腺癌于细胞(BCSCs)的影响.方法 采用改良后的无血清悬浮培养肿瘤干细胞的方法从乳腺癌MCF-7细胞系中分离扩增BCSCs;通过流式侧群细胞分选和免疫缺陷裸鼠腋下接种的方法检测BCSCs的生物学特性和致瘤性.采用Western Blot研究MCF-7及BCSCs中JMJD3表达的差异;采用CCK-8法检测JMJD3促进剂U0126及抑制剂GSK-J1对MCF-7增殖的影响;通过流式细胞侧群分选,检测GSK-J1、U0126对MCF-7中BCSCs比例的影响;采用Western Blot法研究GSK-J1、U0126对BCSCs中JMJD3蛋白表达的影响.结果 改良后的无血清悬浮培养方法可成功地从MCF-7细胞系中分离并富集BCSCs;与MCF-7比较,BCSCs呈现出高致瘤性、JMJD3蛋白低表达性;U0126可抑制MCF-7的增殖,并降低MCF-7中BCSCs的比例,促进BCSCs中JMJD3的表达,而GSK-J1则呈现出相反的作用.结论 JMJD3可抑制乳腺癌细胞的增殖,这种抑制作用可能与减少MCF-7中干细胞的比例有关.
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组蛋白去甲基化酶KDM3B在急性髓系白血病中的靶基因鉴定
目的:组蛋白H3赖氨酸9位(H3K9)的甲基化是造血和白血病发生中关键的表观遗传学修饰,由组蛋白甲基化酶和去甲基化酶精确调控.组蛋白H3K9去甲基化酶KDM3B则是一个潜在的白血病发生抑制基因.我们旨在探讨白血病中KDM3B的潜在靶基因.方法:干涉多个急性髓系白血病细胞株中的KDM3B基因后进行微阵列芯片实验,采用基因集富集分析(GSEA)及Venn分析数据,筛选出若干KDM3B潜在的靶基因,并用实时定量PCR对CDKN1A基因的结果进行验证.结果:对比GSEA的分子标签数据库中标志基因集(H)和已建立的基因集(C2),在NB-4和PLB-985细胞中(分别影响),与KDM3B正相关的基因分别有2 375和2 007个,其中P＜0.05的基因分别有89和67个;与KDM3B负相关的基因分别有1 882和2 250个,其中P ＜0.05的基因分别有62和67个,包括FLT3、NRAS、EVI1和IL4等基因.对比GSEA的分子标签数据库中染色体位置(C1)、已建立的基因集(C2)、模序(C3)、肿瘤相关基因集(C4)、GO基因集(C5)、致瘤基因集(C6)、免疫学基因集(C7)和标志基因集(H),在NB-4和PLB-985细胞中(共同影响),与KDM3 B正相关的基因有4 815个,其中P＜0.05的基因有130个;与KDM3B负相关的基因有4 400个,其中P＜0.05的基因有97个,包括POU5F1和CDKN1A等基因.干扰NB-4和PLB-985细胞中KDM3B基因的表达,我们选取影响强的600个探针用Venn分析,在两种细胞系中表达均下降的基因有16个,包括血液病相关基因CCDN3、TRIM24、MAPKI3、SOX6等;在NB-4细胞中表达降低但在PLB-985细胞中表达升高的基因有17个,包括RARRES3和CD58等基因.实时定量PCR结果显示干扰PLB-985细胞中KDM3B后CDKN1A的表达是对照组的1.18倍.结论:KDM3B调控急性髓系白血病相关基因,CDKN1A是一个潜在的KDM3B靶基因.
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JMJD2A在子宫内膜癌中的表达及意义
目的:探讨组蛋白去甲基化酶JMJD家族中的JMJD2A在正常子宫内膜以及子宫内膜癌中的表达及临床意义.方法:收集临床手术标本,包括子宫内膜癌组织56例,正常子宫内膜组织20例.采用免疫组化的ElⅣisionTM法检测标本中JMJD2A抗体的表达,分析其表达水平与临床病理参数之间的关系,探讨其临床意义.结果:JMJD2A在子宫内膜癌组织中的表达高于正常子宫内膜组织(P<0.05),JMJD2A的表达与年龄、子宫内膜癌的组织学分级和临床病理分期无相关(P>0.05).结论:JMJD2A可能是一个与子宫内膜癌相关的癌基因,高表达提示子宫内膜癌.
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组蛋白去甲基化酶家族中组蛋白去甲基化酶4作用机制及其应用的研究进展
组蛋白甲基化是一种重要的表观遗传性修饰方式,是一个可逆的动态调节过程.组蛋白去甲基化酶家族中组蛋白去甲基化酶4能催化去除组蛋白赖氨酸残基甲基标记,调节染色质的结构,参与精细调控基因转录,维持染色质的活性和非活性平衡.组蛋白去甲基化酶4异常可能导致细胞增殖、分化、个体发育、能量代谢及肿瘤发生发展等多种生物进程异常.研究显示组蛋白去甲基化酶4可作为新的药物靶标.本文就组蛋白去甲基化酶4家族的结构、作用机制、在疾病发生发展进程中的生物学功能及特异性抑制剂开发的新研究进展作一综述.
