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纳米雄黄肾毒性的代谢组学研究
采用色谱-质谱联用的代谢组学方法分析纳米雄黄对大鼠肾脏中内源性小分子代谢物的影响,研究代谢物谱变化与肾毒性之间的关联性,为纳米雄黄毒性机制的深入研究、纳米雄黄药物的临床应用提供依据.将SD大鼠随机分为溶媒对照组、雄黄低中高剂量组和纳米雄黄低中高剂量组(40,200,1 000 mg/kg)共7组,连续灌胃28 d后处死大鼠,收集血清和肾脏样本.经血生化和组织病理学检查,证实纳米雄黄可导致肾脏损伤,且受损程度呈剂量依赖性.同时采用LC-MS和GC-MS对肾脏中代谢物变化进行整体表征,利用模式识别进行数据挖掘,发现高剂量纳米雄黄组大鼠肾脏样本中半胱氨酸、蛋氨酸、脯氨酸及LysoPE、LysoPC等32个代谢物含量较对照组均发生明显改变,提示上述代谢物与纳米雄黄肾毒性相关,为潜在毒性标志物.代谢通路分析结果表明,纳米雄黄对肾脏的毒性机制可能与氨基酸和脂质代谢等有关.
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纳米雄黄研究概述
在我国第一部药物学专著《神农本草经》上就有记载的雄黄是中医内治外用常用药之一,其主要成分为四硫化四砷(As4S4),用传统中药制剂工艺使其入药非常困难,需经研磨、水飞等繁复工艺,耗时废料.由于难溶于水,在胃肠道仅极少部分被吸收.因此,在临床治疗中存在着口服剂量大、潜在毒性较大且生物利用度较低等缺点[1].然而,近年来临床上雄黄治疗急性早幼粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病等恶性血液系统疾病取得显著疗效[2,3],引起了人们对其广泛关注.
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纳米雄黄的抗小鼠原位乳腺癌作用及其机制
目的:研究纳米雄黄体内体外对小鼠乳腺癌细胞(4T1)的增殖抑制作用及其机制.方法:以萤火虫荧光素酶(Luciferase,Luc)基因标记小鼠4T1乳腺癌(4T1-Luc)细胞,应用噻唑蓝(MTT)比色法和生物发光法(Bioluminescent method,BLM)检测细胞增殖活性；细胞形态学及Annexin V/PI双标记法观察细胞凋亡.4T1-Luc细胞接种雌性BALB/c小鼠乳腺脂肪垫制作原位乳腺癌模型,纳米雄黄(4和8 mg· kg-1·d-1)灌胃治疗20 d,小动物活体成像系统连续动态观察小鼠乳腺肿瘤生长变化,治疗末期处死动物、剥离肿瘤块称重,并制片HE染色和CD34标记观测肿瘤组织内细胞核分裂像、新生血管形成及坏死改变.结果:MTT法和BLM法检测显示1.56～50 μg/mL纳米雄黄体外显著抑制4T1-Luc细胞的增殖(P＜0.05)；形态学观察和Annexin V/PI染色显示细胞呈现典型的凋亡改变.体内纳米雄黄呈时间和剂量依赖性地抑制小鼠4T1-Luc原位乳腺癌的生长(P＜0.05)；肿瘤组织制片观察,经纳米雄黄治疗后肿瘤组织内细胞核分裂像和微小血管显著减少(P＜0.01),肿瘤组织内部呈显著的坏死改变.结论:纳米雄黄体外抑制小鼠乳腺癌4T1细胞增殖和诱导细胞凋亡,并主要通过减低原位肿瘤组织内新生血管的形成而导致肿瘤组织坏死而发挥抗乳腺癌作用.
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纳米雄黄抗B细胞非霍奇金淋巴瘤Raji细胞的体外作用研究
目的 考察纳米雄黄对B细胞非霍奇金淋巴瘤Raji细胞的体外作用.方法 利用激光粒度仪、TEM和AFM对纳米雄黄和水飞雄黄进行表征;利用光镜、AFM和TEM依次观察纳米雄黄和水飞雄黄作用下Raji细胞的增殖形态变化、单细胞表面细胞膜变化以及细胞内超微结构的变化;MTT法检测纳米雄黄和水飞雄黄作用下的细胞存活率;利用荧光显微镜及流式细胞术观察纳米雄黄和水飞雄黄引起Raji细胞的凋亡和细胞周期分布情况.结果 纳米雄黄的粒径为(79±8)nm,水飞雄黄的粒径为(1.89±0.2)μm.光镜下,可明显观察到纳米雄黄可抑制Raji细胞的聚集生长状态,AFM下可观察到纳米雄黄作用下的Raji细胞皱缩,体积变小,膜表面的黏附物质不再向四周伸展,而水飞雄黄作用下的Raji细胞变化不明显.TEM下可观察到纳米雄黄作用下的Raji细胞胞内亚细胞器受到破坏,线粒体空泡明显增多,水飞雄黄组变化不明显.MTT结果显示,50 mg·L-1纳米雄黄作用Raji细胞24 h时,细胞的存活率为(40±2)%,而相同剂量的水飞雄黄作用组为(65±3)%;50 mg·L-1纳米雄黄作用Raji细胞48 h时,Raji细胞的存活率仅为10%,而相同剂量的水飞雄黄组,Raji细胞的存活率为(42±2)%.荧光显微镜下可观察到纳米雄黄作用下的Raji细胞核凋亡明显,水飞雄黄组作用不明显.流式细胞术结果显示,水飞雄黄作用下的Raji细胞总凋亡率为11.14%,而纳米雄黄处理组的Raji细胞总凋亡率为15.9%.与水飞雄黄相比,纳米雄黄作用下Raji细胞在G 1期的分布比例明显升高,S期分布比率下降.结论 与水飞雄黄相比,相同剂量的纳米雄黄在相同作用时间下,可明显抑制B细胞淋巴瘤Raji细胞的增殖,破坏其亚细胞结构,进而引起其凋亡.
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纳米雄黄对乳腺癌MCF-7细胞侵袭转移恶性行为的影响
目的：观察纳米雄黄对乳腺癌MCF-7细胞侵袭转移恶性行为的影响。方法：体外培养乳腺癌MCF-7细胞，不同浓度纳米雄黄溶液干预，并设立对照组，采用划痕实验、Transwell侵袭实验分别检测各组细胞迁移、侵袭情况。结果：与对照组比较，各给药组迁移值均小于对照组（P<0.05或P<0.01）；与阿霉素组比较，各纳米雄黄组迁移值均大于阿霉素组（P<0.05或P<0.01）；且随纳米雄黄浓度升高，迁移值减小。纳米雄黄低、中、高剂量组及阿霉素组的侵袭抑制率分别为9.36%、19.93%、25.02%、38.44%。结论：纳米雄黄可抑制乳腺癌MCF-7细胞迁移、侵袭，具有抗乳腺癌转移作用。
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纳米雄黄对肺癌A549细胞的凋亡诱导作用
目的:研究纳米雄黄对肺癌A549细胞的凋亡诱导作用.方法:采用机械研磨法制备纳米雄黄.以肺癌A549细胞株为靶细胞,采用MTT法检测细胞的增殖活性,AnnexinV/PI双染色法检测A549细胞的凋亡,流式细胞术检测BAX蛋白和Bcl-2蛋白表达、Caspase-3活性、P53蛋白的表达.结果:纳米雄黄可显著抑制A549细胞的增殖,50μg/mL和100μg/mL的纳米雄黄处理48h后,A549细胞凋亡率显著增高为12.53%和69.19%;20μg/mL和50μg/mL的纳米雄黄作用24h,A549细胞中活性caspase-3由对照的(2.25±0.17)%增高到(3.84±0.63)%和(7.35±0.33)%;P53蛋白表达总体增高但加药48h高剂量组也有所降低;Bax蛋白表达由对照的(79.50±0.50)%增高到(92.45±0.35)%和(96.9±0.00)%;Bcl-2蛋白表达由对照的(77.85±2.15)%增高到(87.10±10.5)%和(83.1±4.6)%.结论:纳米雄黄可有效诱导肺癌A549细胞发生凋亡.
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纳米雄黄外用治疗肠癌溃破创面的临床观察
目的:探讨纳米雄黄外用治疗肠癌溃破创面的临床疗效.方法:将52例肠癌溃破创面患者随机分为两组,对照组26例口服康复新液,同时清洁换药后湿敷浓度为3％的平阳霉素溶液;治疗组26例在口服康复新液的基础上加用纳米雄黄外涂.观察治疗后两组有效率、相关肿瘤标志物水平以及不良并发症的情况.结果:治疗组总有效率为46.15％(12/26),显著高于对照组的26.92％(7/26)(P＜0.05);两组血清CEA、CA199及CA724水平均明显降低(P＜0.01),但组间比较,差异均无统计学意义(P＞0.05);治疗组并发症发生率为23.08％(6/26),明显低于对照组的46.15％(12/26)(P＜0.01).结论:纳米雄黄外敷对肠癌溃破创面有较好的治疗效果,能减轻患者痛苦,促进肿瘤溃破创面愈合.
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纳米雄黄的药理活性及毒性研究进展
纳米雄黄是由传统矿物中药雄黄制备而成的纳米级药物, 具有生物利用度高、靶向性强等生物学特征.本文综述了近年来纳米雄黄在药理及毒性作用方面取得的新研究进展, 为其深入研究开发提供参考.
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纳米雄黄对卵巢癌细胞增殖凋亡的调控作用及分子机制研究
目的：探讨纳米雄黄对卵巢癌细胞Skov3增殖和凋亡的影响及其潜在分子机制。方法：采用机械研磨法制备纳米雄黄；以Skov3细胞为靶细胞，分别采用MTT实验及流式细胞术检测细胞增殖能力和凋亡情况；同时，利用Western blot检测细胞内Bcl-2及Bax蛋白的表达变化。结果：纳米雄黄能够显著抑制细胞增殖能力；40mg/L和80mg/L纳米雄黄处理Skov3细胞48小时，细胞凋亡显著增加；40mg/L纳米雄黄处理Skov3细胞48小时，Skov3细胞内Bcl-2蛋白表达水平显著降低，Bax蛋白表达显著增加。结论：纳米雄黄能够显著抑制Skov3细胞增殖，促进其凋亡，可能通过抑制细胞内Bcl-2蛋白的表达，上调Bax蛋白表达发挥抑制卵巢癌的发生发展的作用。
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纳米雄黄对人宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响
目的:探讨纳米雄黄对不同宫颈癌细胞株Hela(HPV18阳性,腺癌),Caski(HPV16阳性,鳞癌),C33A(HPV阴性,腺癌)增殖、凋亡的影响.方法:体外培养3种不同宫颈癌细胞,采用不同质量浓度(5,10,20,40 mg/L)纳米雄黄作用于不同宫颈癌细胞24,48,72,96 h,相差显微镜下观察不同质量浓度组与对照组细胞形态学变化;MTT法测定药物对细胞生长的抑制作用;流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期.结果:纳米雄黄混悬液(5,10,20,40 mg/L)作用于Caski,Hela,C33A细胞24,48,72,96h,均可抑制细胞增殖,且呈时间剂量依赖性,抑制率波动于9.02％～49.06％,以20 mg/L质量浓度组为例,抑制率Caski(39.15％) ＞Hela(36.17％)＞ C33A(30.56％).随着质量浓度的增加,早期凋亡、中晚期凋亡细胞均增加,凋亡率(早期+中晚期凋亡率)波动于19.29％～99.54％,以20 mg/L质量浓度组为例,凋亡率Caski(60.43±2.88)％＞Hela (41.95±3.01)％＞C33A (43.49±2.19)％.细胞周期结果显示高质量浓度组(20,40 mg/L)对Hela,Caski细胞有G2/M期阻滞.结论:纳米雄黄混悬液可抑制不同宫颈癌细胞株的增殖,促进细胞凋亡,其对Caski细胞的作用强,对Hela细胞次之,对C33A细胞相对弱.对HPV阳性的细胞可产生G2/M期阻滞.
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纳米雄黄外用治疗乳腺癌破溃创面的临床观察
目的 观察纳米雄黄外用治疗乳腺癌胸部破溃创面的效果并探讨其机制,证实纳米雄黄外用的安全性和有效性.方法 将乳腺癌胸部破溃创面患者60例,按随机数字表法分为对照组及观察组,两组均行保乳术治疗,术后给予化疗及中药支持治疗,对照组30例常规清洁护理,以5％的环磷酰胺溶液清创后湿敷,隔日换药1次;观察组30例常规清洁换药后外敷纳米雄黄,隔日1次.比较两组近远期临床疗效,治疗期间的不良反应及治疗前后生存质量及血清肿瘤标志物水平.结果 观察组总有效率为76.67％.显著高于对照组的53.33％(P＜ 0.05),观察组治疗后1年、2年生存率显著高于对照组(P＜0.01).治疗后两组血清血清癌胚抗原(CEA)、糖类抗原153(CA153)、恶性肿瘤特异性生长因子(TSGF)水平均明显降低(P＜0.01),组间差异无统计学意义(P＞0.05);观察组乳腺癌生存质量测评量表(FACT-B)评分明显高于治疗前及对照组(P＜0.0l).结论 纳米雄黄外用可提高对乳腺癌破溃创面的治疗效果.
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纳米雄黄对卵巢癌细胞COC1凋亡的影响
目的 探讨纳米雄黄对卵巢癌细胞COC1的凋亡作用.方法 0.6 μmol/L浓度的纳米雄黄作用于COC1细胞,于不同时间收集的细胞.倒置显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞凋亡率,RT-PCR检测细胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3的mRNA的表达水平,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达水平.结果 0.6μmol/L浓度的纳米雄黄作用于COC1细胞48 h后出现显著的凋亡形态改变;纳米雄黄显著的促进细胞凋亡,并随着纳米雄黄处理COC1细胞时间的延长凋亡率显著性增加(P＜0.05);随着纳米雄黄处理间的延长COC1细胞中的Bax和Caspase-3的mRNA和蛋白表达水平显著增加(P＜0.05),Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P＜0.05).结论 纳米雄黄对COC1细胞有显著的促凋亡作用,其作用机制可能与升高Bax和Caspase-3的表达和降低Bcl-2的表达有关.
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纳米雄黄对白血病K562细胞及其干细胞的凋亡诱导作用
目的:研究纳米雄黄对白血病K562细胞及其白血病干细胞的凋亡诱导作用.方法:采用机械研磨法制备纳米雄黄.以白血病K562细胞为靶细胞,MTT法检测K562细胞增殖活性,采用流式细胞术检测K562细胞凋亡率、P-gp和BCRP蛋白的表达水平,以及白血病干细胞含量变化及其凋亡.结果:雄黄经高能球磨机球磨10～50h,扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)观察,电镜测量纳米雄黄的平均粒径为72.72±22.18 nm.20μg/ml和50μg/ml纳米雄黄及雄黄原药处理K562细胞后,纳米雄黄对K562细胞有明显的增殖抑制作用,24h、48h、72h的IC50值分别为43.48 μg/ml、20.52μμg/ml、16.07 μg/ml.细胞的凋亡率明显升高.雄黄原药对K562细胞也有增殖抑制及凋亡诱导作用,但效果要差于纳米雄黄.BCRP、P-gp蛋白表达以及二者共表达率随着时间的延长和浓度的增高呈上升趋势,尤以高浓度时明显.20μg/ml和50μg/ml纳米雄黄处理K562细胞24h,LSC含量随浓度升高而升高,K562细胞群中LSC的凋亡率升高.结论:纳米雄黄可诱导药物敏感性白血病细胞及其白血病干细胞发生凋亡.
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纳米雄黄混悬液诱导卵巢癌SKOV3细胞凋亡及其对Bcl-2/Bax表达的影响
目的 探讨纳米雄黄混悬液对卵巢癌SKOV3细胞增殖抑制作用、凋亡诱导效应及其对Bcl-2/Bax表达的影响.方法 应用不同质量浓度(6.25 mg·L-1、12.5 mg·L-1、25 mg·L-1、50 mg·L-1)的纳米雄黄混悬液作用于SKOV3细胞不同时间(12 h、24 h、48 h、72 h)后,倒置显微镜下观察各实验组和对照(不加药物)组细胞的形态学变化;MTT比色法测定细胞生长抑制情况;流式细胞仪检测细胞凋亡率;荧光定量PCR法检测Bc1-2/Bax的表达.结果 6.25 mg·L-1、12.5 mg·L-1、25 mg·L-1、50 mg·L-1不同浓度纳米雄黄混悬液对卵巢癌SK-OV3细胞的增殖有抑制作用,这种增殖抑制作用在一定范围内呈时间剂量依赖关系.25 mg·L-1、50 mg·L-纳米雄黄混悬液作用48h后,SKOV3细胞出现凋亡细胞的形态学改变;25 mg·L-1、50 mg·L-1纳米雄黄混悬液处理SKOV3细胞48h后,流式细胞术检测呈现明显的凋亡峰,凋亡率分剐为(14.62±0.96)％、(25.83±1.42)％;50 mg·L-1纳米雄黄混悬液处理SKOV3细胞48h后Bcl-2基因表达减弱,Bax基因表达增强.结论 纳米雄黄混悬液可抑制卵巢癌SKOV3细胞的生长、增殖,并有明显的诱导凋亡作用,而下调Bcl-2表达及上调Bax表达可能是其诱导凋亡的机制.
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纳米雄黄抑制A431细胞株新生血管的机制研究
目的:探讨纳米雄黄抑制人皮肤鳞癌A431细胞新生血管的作用及其相关机理.方法:对皮肤鳞癌A431细胞进行体外培养,分别采用免疫组织化学法和RT-PCR法检测不同浓度纳米雄黄处理后其色素上皮源性因子(PEDF)和VEGF mRNA的表达情况.结果:对照组、5％、15％、25％纳米雄黄组、DDP组、综合组A431细胞PEDF表达阳性率分别为(21.50±2.28)％、(28.81±2.75)％、(42.23±2.35)％、(56.80±3.80)％、(46.33±2.07)％、(59.82±4.80)％；VEGF mRNA相对表达量为(86.30±6.44)％、(72.45±5.37)％、(52.74±7.21)％、(44.81 ±4.34)％、(30.92 ±4.12)％、(18.35±5.09)％.可见,经纳米雄黄作用后,人皮肤鳞癌A431细胞PEDF的生成量明显升高,VEGF转录mRNA水平显著降低,均呈剂量依赖性,与顺铂联合有协同作用.结论:体外实验表明纳米雄黄抑制A431新生血管生成的作用可能与上调PEDF的表达和下调VEGF的表达有关.
关键词： 纳米雄黄 皮肤鳞癌A431细胞 肿瘤血管生成 PEDF VEGF -
纳米雄黄外用治疗癌性溃疡疗效观察
目的:观察中药纳米雄黄外用治疗癌性溃疡的临床疗效.方法:将癌性溃疡患者50例随机分为2组各25例,对照组清洁换药后外涂甲硝唑和庆大霉素,同时外敷顺铂溶液,2次/d;研究组在对照组治疗的基础上加用纳米雄黄外用,2次/d.观察2组患者创面愈合率和新生肉芽及上皮组织生长情况.结果:研究组创面愈合时间短于对照组(P<0.05),有效率较高于对照组(P<0.05).结论:纳米雄黄外用可提高癌性溃疡的治疗效果.
