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氢分子通过激活自噬抑制C/EBP同源蛋白 介导的巨噬细胞凋亡
目的:研究氢分子对氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导巨噬细胞凋亡的影响,并探讨可能的分子机制.方法:体外培养鼠源RAW264.7巨噬细胞,处理前更换为饱和含氢培养基,分别给予3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA;5 mmol/L)和雷帕霉素(rapamycin,Rap;3μmol/L)预处理1 h,再加入ox-LDL(100 mg/L)继续培养24 h.分别采用MTT法和Annexin V-FITC双染法检测细胞活力和凋亡情况,试剂盒测定培养基中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性,Western blot法检测自噬标志分子beclin-1和内质网应激相关促凋亡蛋白C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)表达的变化,激光共聚焦显微镜观测细胞内微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)的表达变化.结果:氢分子显著抑制ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞活力降低、LDH漏出增加、细胞凋亡及CHOP表达上调;ox-LDL诱导巨噬细胞自噬反应,表现为beclin-1表达上调,LC3颗粒化聚集,而氢分子可进一步促进ox-LDL对细胞自噬的诱导作用,且氢分子的这种促进作用可被自噬抑制剂3-MA拮抗,而被自噬诱导剂Rap增强(P<0.01).另外,氢分子对ox-LDL所致的巨噬细胞凋亡、细胞活力降低及CHOP上调的抑制作用也可被3-MA拮抗,而被Rap促进.在体外培养的人源THP-1巨噬细胞中也观察到类似的结果,即氢分子不仅可抑制ox-LDL诱导的细胞凋亡和CHOP上调,也可使beclin-1表达进一步上调(P<0.01).结论:氢分子可通过下调CHOP表达抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞凋亡,其上游机制可能是通过激活自噬实现的.
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β1-肾上腺素受体自身抗体通过激活内质网应激诱导心肌细胞凋亡
目的:探讨内质网应激在β1-肾上腺素受体自身抗体(β1-AA)引起心肌细胞凋亡中的作用.方法:采用β1-肾上腺素受体细胞外第二环抗原肽段主动免疫大鼠,应用SA-ELISA法检测大鼠血清中β1-AA的水平,TUNEL染色检测心肌组织的凋亡水平,Western blot法和免疫组化法检测心肌组织中葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)及caspase-12的蛋白表达.利用亲和层析法纯化的β1-AA处理H9c2心肌细胞,CCK-8法检测细胞活力,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测心肌细胞凋亡;采用内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA)预处理H9c2心肌细胞,再给予β1-AA干预,CCK-8法和流式细胞术分别检测细胞活力及凋亡的变化情况.结果:与对照组相比,主动免疫大鼠血清中β1-AA水平在免疫2周时显著增加,进一步增加至8周,并且主动免疫2周大鼠心肌组织凋亡率明显升高,持续升高至8周.与对照组相比,主动免疫大鼠心肌组织中GRP78、CHOP及caspase-12的蛋白表达在免疫4周和8周时均明显增加.β1-AA引起H9c2心肌细胞活力持续降低,凋亡明显增加.与β1-AA单独处理组相比,内质网应激抑制剂4-PBA预处理H9c2心肌细胞可以有效逆转β1-AA诱导的细胞凋亡增加和活力下降.结论:β1-AA可以通过激活内质网应激诱导心肌细胞凋亡.
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瘦素对局灶性脑缺血后内质网应激相关蛋白的作用
目的 探讨瘦素对大鼠局灶性脑缺血后内质网应激相关蛋白的影响.方法 SD大鼠40只,随机分为假手术组、脑缺血组、脑缺血瘦素预处理组,线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,在闭塞血管前3 h皮下注射瘦素,于闭塞血管6 h后采用Longa 5分制量表进行神经功能评分、称量体重及脑水肿变化,并灌注取脑,采用免疫荧光化学法检测内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)及C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein,CHOP)表达.结果 脑缺血瘦素预处理组和脑缺血组体重变化未见差异(P>0.05);脑缺血瘦素预处理组神经功能评分(1.90±0.31 vs.2.50±0.52,P<0.05)和脑水肿程度(3.60±0.52 vs.7.70±0.94,P<0.001)明显轻于脑缺血组,同时脑缺血瘦素预处理组GRP78表达明显高于脑缺血组(48.69±5.06 vs.35.78±4.35,P<0.01),CHOP表达明显低于脑缺血组(38.81±5.34 vs.60.24±4.11,P<0.01).结论 瘦素可减少神经功能缺损并可能与其上调GRP78蛋白,下调CHOP蛋白来减弱脑缺血导致的内质网应激有关.
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局灶性脑缺血大鼠预处理后CHOP mRNA及其蛋白的表达
目的 观察缺血预处理对大鼠脑缺血再灌注后C/EBP同源蛋白(C/EBP homology protein.CHOP)mRNA及其蛋白表达的影响.方法 SD大鼠180只,随机分为假手术组(sham-operation group,SO)、脑缺血再灌注组(middle cerebral artery occlusion,MCAO)、脑缺血预处理组(brain ischemic preconditioning,BIP)3组.每组按照再缺血后12 h、1 d、2 d、3 d其4个时间点分为4个亚组.采用二次线栓法制备大鼠局灶性脑缺血预处理模型.用原位杂交法和免疫印迹法(western blot)观察再缺血后各个时间点CHOP mRNA及其蛋白的表达变化,用流式细胞术检测神经细胞凋亡率.结果 ①MCAO组12 h CHOPmRNA表达达高峰(142.92±7.46,P<0.01).随再灌注时间延长其表达逐渐下降;BIP组缺血各时间点其表达水平均显著下降(12 h:157.7±8.37;24 h:167.54±8.99;2 d:178.16±9.25;3 d:186.85±9.82,P<0.05).②MCAO组CHOP蛋白表达于缺血再灌注后12 h开始明显上升,24 h达高峰,2 d后表达开始减弱(1.674 4±0.136,P<0.01);BIP组较MCAO组CHOP表达明显降低(12 h:1.453±0.128;24 h:1.605±0.132;2 d:1.485±0.129;3 d:1.279±0.115,P<0.05,P<0.01.③MCAO组12 h细胞凋亡发生率显著增加(34.6%±11.5%),1 d时达到高峰(48.2%±12.4%),以后时间点逐渐下降;BIP组各个时间点神经元凋亡发生率较MCAO组显著降低(12 h:25.3%±9.0%;24 h:36.4%±10.9%;2 d:30.8%±11.2%;3 d:22.5%±8.7%,P<0.05.P<0.01.结论 脑缺血预处理可能通过抑制CHOP表达发挥其神经保护作用.
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缺氧预处理对大鼠创伤性颅脑损伤后内质网应激的影响
目的 探讨缺氧预处理(HPC)对创伤性颅脑损伤(TBI)大鼠脑皮质促凋亡蛋白C/EBP同源蛋白(CHOP)表达、神经细胞凋亡及神经功能的影响. 方法 健康雄性SD大鼠48只按随机数字表法分为HPC组(给予HPC模型制作)和未HPC组(不做预处理),每组24只;然后进一步分别按随机数字表法分为对照组(不做任何处理)及TBI 1 d、3d、7d亚组(给予TBI模型制作并分别于相应时间点观察、取材),每组6只.大鼠在低压氧仓中进行每天3h、连续3d训练以给予HPC,采用改良的Freeny's法制作TBI模型.对各组大鼠进行改良神经功能严重程度评分(mNSS),采用qRT-PCR及Western blotting检测挫伤区周围皮质CHOPmRNA及蛋白表达,采用TUNEL法检测神经细胞凋亡情况,采用统计学方法分析CHOP表达水平与神经细胞凋亡指数的相关性. 结果 TBI 1 d、3d、7d亚组大鼠mNSS评分、CHOP mRNA和蛋白相对表达量、神经细胞凋亡指数均较对照组明显增高,并在3d时达到高峰,差异均有统计学意义(P＜0.05);同时HPC组中TBI1d、3d、7d亚组mNSS评分、CHOP mRNA和蛋白相对表达量、神经细胞凋亡指数均明显低于未HPC组中相应亚组,差异均有统计学意义(P＜0.05).HPC组和未HPC组中TBI 1 d、3d、7d亚组CHOP表达水平与神经细胞凋亡指数呈正相关关系(r=0.957,P=0.000;r=0.966,=0.000). 结论 HPC通过下调内质网应激途径中CHOP的表达水平以减少神经细胞凋亡,从而改善神经功能.
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单宁酸调控ATF6-CHOP通路增强顺铂诱导肝癌HepG2细胞凋亡的作用
目的 检测内质网应激ATF6-CHOP通路的激活水平,以探究单宁酸(TA)联合顺铂(CDDP)抗肝癌的分子机制.方法 用180μmol/L TA、0.9μ/g mLCDDP单独用药或者联合用药处理肝癌HepG2细胞24和48 h后,利用实时荧光定量PCR (q-RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western Blot)技术检测细胞ATF6(ATF6α)、ATF6B(ATF6β)和CHOP的表达水平.结果 药物处理24和48 h后,与对照组相比,TA组、CD-DP组和联合用药组ATF6 mRNA和蛋白水平、ATF6B蛋白水平、CHOP mRNA和蛋白水平均显著升高(P＜0.01或P＜0.05).结论 TA能够联合CDDP增强肝癌HepG2细胞内质网应激ATF6-CHOP通路的激活水平,ATF6-CHOP通路可能是TA和CDDP协同抗肝癌的分子机制之一.
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BiP、CHOP和p-JNK在多囊卵巢综合征患者血白细胞中的表达
目的:探讨内质网应激(ERS)标志性蛋白中免疫球蛋白结合蛋白(BiP)、C/EBP同源蛋白(CHOP)及磷酸化-氨基末端激酶(p-JNK)在多囊卵巢综合征(PCOS)患者血白细胞中的表达.方法:选择PCOS不孕就诊的患者44例(PCOS组)和因男方因素或输卵管因素不孕就诊的患者50例(对照组)为研究对象.PCOS组根据胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)分为胰岛素抵抗组(22例)与非胰岛素抵抗组(22例).应用RT-PCR和Western Blotting方法检测患者血白细胞中BiP、CHOP、JNK、磷酸化-氨基末端激酶(p-JNK)的表达水平.结果:PCOS组BiP mRNA水平(1.67±1.02)及蛋白水平(0.76 ±0.12)均明显高于对照组(分别为1.04±0.54、0.65±0.09),差异有统计学意义(P＜0.05).PCOS组CHOP mRNA水平(0.79 ±0.49)及蛋白水平(0.75 ±0.30)均较对照组(分别为0.63±0.47、0.71 ±0.25)有增高趋势,但差异无统计学意义(P＞0.05).PCOS组JNK蛋白水平与对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).PCOS组p-JNK蛋白水平(0.87 ±0.17)明显高于对照组(0.71±0.09),差异有统计学意义(P＜0.05).PCOS患者中胰岛素抵抗组和非胰岛素抵抗组的BiP、CHOP mRNA水平及蛋白水平比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论:PCOS患者血白细胞中ERS标志性蛋白BiP、p-JNK的表达异常,提示ERS可能通过活化JNK信号通路参与PCOS的发病.
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内质网应激前后肝癌细胞中C/EBP同源蛋白及X-盒-结合蛋白-1的表达
目的:观察内质网应激(ERS)标志蛋白x-盒-结合蛋白-1(XBP-1)和C/EBP同源蛋白(CHOP)在正常肝细胞及不同分化程度肝癌细胞中的表达.方法:将培养获得的正常肝细胞LO2、高分化肝癌细胞株HepG2及低分化肝癌细胞株SMMC-7721细胞分为无水乙醇未处理组(ERS前组)和无水乙醇处理组(ERS组),ERS组的3种细胞分别给予无水乙醇处理获得ERS细胞模型;采用Western Blot方法检测3种细胞ERS前后XBP-1、CHOP表达.结果:在ERS前组中,XBP-1表达从高到低依次为LO2、HepG2、SMMC-7721;ERS组中,XBP-1在3种细胞中的表达都上调,与ERS前组比较差异有统计学意义(P＜0.05),增加量从高到低依次为SMMC-7721、LO2及HepG2,3种细胞间两两比较差异无统计学意义(P＞0.05);ERS前后,HepG2细胞中均无CHOP表达;ERS前组中,CHOP表达高低依次为SMMC-7721、LO2;ERS组中,CHOP在LO2细胞及SMMC-7721细胞表达均上调,与ERS前组比较差异有统计学意义(P＜0.05),而在SMMC-7721细胞中表达上调更明显(与LO2细胞比较,P＜0.05).结论:发生ERS后,LO2、HepG2及SMMC-7721细胞中XBP-1的表达水平都升高,分化程度低的SMMC-7721细胞中的XBP-1及CHOP的表达升高更明显.
关键词： 肝肿瘤 肝细胞 内质网应激 X-盒-结合蛋白-1 C/EBP同源蛋白 -
内质网应激相关CHOP在SAH后细胞凋亡中的作用及机制
目的 探讨内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)相关C/EBP同源蛋白(C/EBP homoiogousprotein,CHOP)在蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)后神经元凋亡的作用机制.方法 血管内穿刺方法建立大鼠SAH模型,脑室内给药建立SAH+sh-con组和SAH+sh-RNAi组,应用神经行为学评分法进行神经行为学评分,Real-time PCR检测Caspase-3、Bim、Bcl-2的mRNA表达,Western blot检测CHOP蛋白表达,TUNEL法检测神经元凋亡.结果 SAH组和SAH+sh-con组Caspase-3、Bim mRNA及CHOP蛋白表达较空白组明显增多,Bcl-2 mRNA表达减少,神经元凋亡增多(P<0.05);与空白组比较,SAH+sh-RNAi组Caspase-3、Bim mRNA及CHOP蛋白表达增多,Bcl-2 mRNA表达减少,神经元凋亡增多,差异有统计学意义(P<0.05),而与SAH组和SAH+sh-con组比较,Caspase-3、Bim mRNA及CHOP蛋白表达减少,Bcl-2 mRNA表达增多,神经元凋亡减少,差异具有统计学意义(P<0.05);CHOP蛋白表达增多与神经元凋亡之间存在正相关(r=0.832,P<0.05).结论 ERS凋亡通路参与了SAH后神经元凋亡过程,抑制CHOP蛋白表达可以有效减少凋亡以改善预后.
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C/EBP同源蛋白在严重创伤性脑损伤患者中的表达
目的 研究C/EBP同源蛋白(C/EBP homology protein,CHOP)在严重创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)患者颅脑周围组织中的表达,探讨其与损伤严重程度的关系. 方法 选取41例TBI患者(TBI组)颅脑周围组织,并选取因其他疾病(排除TBI及其他中枢神经系统疾病)死亡的16例尸检标本作为对照组,对照组及TBI组按年龄分为未成年组(≤18岁)、成年组(18 ～59岁)和老年组(＞59岁).TBI组患者根据入院时GCS评分再分为重型TBI组(GCS 6 ～8分)和特重型TBI组(GCS 3～5分).比较不同年龄、性别及GCS组间CHOP在TBI周围组织中的表达差异.TUNEL法检测神经细胞凋亡,并对CHOP表达水平与凋亡数量进行相关性分析. 结果 对照组CHOP表达在年龄与性别间差异无统计学意义(P＞0.05).与对照组比较,TBI组CHOP表达显著上调(P＜0.05).在TBI组中,CHOP表达在性别间差异无统计学意义(P＞0.05),而老年组患者CHOP表达低于成年组和未成年组(P＜0.05),特重型TBI组明显高于重型TBI组(P＜0.05).TBI组较对照组神经细胞凋亡数量明显增加(P＜0.05),且CHOP表达水平与凋亡指数呈正相关(r =0.72,P＜0.05). 结论 TBI后CHOP表达水平与损伤严重程度及神经细胞凋亡密切相关,但CHOP诱导的凋亡途径可能不是老年组TBI后继发性脑损害的主要因素.
