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人源化小鼠在肿瘤免疫治疗研究中的应用
随着肿瘤免疫学的快速发展,肿瘤的免疫治疗已成为肿瘤药物开发中的一个热点领域.然而,由于哺乳动物间免疫系统的种属差异性,现有的动物模型不能准确地预测人类免疫系统与肿瘤的相互作用.许多在临床前动物模型中具有良好治疗效果的抗肿瘤药物在肿瘤患者体内却不能发挥相应的药效.因此,肿瘤免疫治疗药物的临床前评价亟需合适的动物模型.人源化小鼠是通过将人源细胞或组织移植到免疫缺陷小鼠体内构建的小鼠模型.与传统动物模型相比,人免疫系统(Human immune system,HIS)小鼠、人免疫系统肿瘤(Human immune systemtumor mice,HTM)小鼠、患者来源的异种移植肿瘤(Patient-derived xenograft tumor,PDX)小鼠、和人免疫系统PDX小鼠等人源化小鼠模型能够较好的模拟人免疫系统和患者的肿瘤微环境,为肿瘤免疫治疗的体内研究提供了可靠地平台.文章主要对免疫缺陷小鼠的发展和不同人源化小鼠的构建以及在肿瘤治疗研究中的应用作一综述.
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B细胞成熟抗原的抗肿瘤免疫治疗研究进展
B细胞表面成熟抗原(B-cell maturation antigen,BCMA)是一种浆细胞选择性的蛋白,早发现于成熟的B淋巴细胞表面,在其他组织细胞中几乎不表达.其在恶性增殖的B淋巴细胞(例如骨髓瘤细胞、白血病细胞)中高度表达,同时其介导的下游信号通路,对细胞的存活、增殖、转移和耐药中起着关键性的作用,这些特性使得它成为免疫治疗多发性骨髓瘤的一个靶点.近年来,针对BCMA的新型肿瘤免疫治疗方法日趋成熟,主要包括CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)疗法、双特异性抗体(Bispecific antibody,BsAb)和抗体药物偶联物(Antibody-drug coupling,ADC)3大阵营,且目前已有4类药物进入临床Ⅰ期.从已经公开的临床前及临床Ⅰ期试验的结果来看,针对BCMA的靶向药物能够有效的靶向肿瘤细胞,并通过免疫细胞或小分子的细胞毒作用杀伤肿瘤细胞,药效显著,不良反应可控,是一个极具发展潜力的肿瘤靶向治疗新靶点.该文就BCMA的生物学功能、信号通路以及以其为靶点的肿瘤免疫治疗药物进行综述.
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靶向T细胞共信号的肿瘤免疫治疗研究进展
T细胞介导的肿瘤免疫至少需要T细胞受体和共刺激分子"双信号"参与的学说目前得到了广泛支持.共抑制或共刺激分子提供的共信号决定了T细胞受体信号介导的免疫应答的终效应.近年来,靶向共抑制分子如CTLA-4和PD-1开发的抗体药物在临床应用中获得了巨大成功,使得肿瘤免疫治疗成为令人瞩目的研究领域,并被美国《科学》杂志评为2013年度十大科学突破之首.肿瘤免疫治疗有望成为与手术、放化疗和靶向治疗并驾齐驱的抗肿瘤主流治疗方案.针对共抑制分子CTLA-4、PD-1、PD-L1和共刺激分子CD137,综述其发挥免疫调节作用的分子机制及其相关靶向药物在肿瘤治疗方面的新进展和应用.
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肿瘤免疫治疗——遇上好的时代
肿瘤免疫治疗被称为继手术、放疗、化疗后第4种肿瘤疗法,其可激活特异性、重要的免疫细胞,直接靶向性攻击癌症细胞,具有较高的疗效和安全性,是目前全球肿瘤治疗研究的热点.报告采用文献调研、数据库检索、数据统计与分析等定性定量研究方法,从市场预测、发展历程、国内外企业布局情况等方面对肿瘤免疫治疗药物领域进行多角度、多层次的分析,旨在为相关企业明确发展方向、确定产品研发思路及制定市场策略提供线索和参考.
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同种异基因皮肤移植对小鼠抗肿瘤效应的影响
目的：研究同种异基因皮肤移植的排斥反应对小鼠抗肿瘤能力的影响。方法：将BALB／c鼠（ H-2 d基因型）分成同种皮肤移植组（ C57BL／6鼠为供者，H-2b 基因型）、同系皮肤移植组（其他BALB／c鼠为供者）和未移植组，分别皮下接种C57BL／6鼠来源的黑色素瘤细胞（B16，H-2b基因型）或者BALB／c鼠来源的骨髓瘤细胞（ SP2／0，H-2 d基因型），观察移植排斥和肿瘤生长情况，检测脾细胞群中的CD3＋、CD8＋T细胞和H-2Kb 同种反应性CD8＋T细胞的比例以及肿瘤组织中CD3＋T细胞的浸润程度。结果：B16细胞接种同种皮肤移植组小鼠后瘤体生长缓慢，直至完全消失，而接种同系皮肤移植组小鼠和未移植组小鼠后瘤体生长迅速；SP2／0细胞接种同种皮肤移植组小鼠、同系皮肤移植组小鼠和未移植组小鼠后瘤体均生长迅速，3组之间差异无统计学意义。同种皮肤移植鼠脾细胞群中针对H-2Kb 移植抗原的同种反应性CD8＋T细胞比例明显高于同系皮肤移植鼠。结论：同种皮肤移植引起的排斥反应只对拥有同种异基因的肿瘤细胞具有排斥作用，而对与受者基因同源的肿瘤细胞并无明显的交叉免疫反应。
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热休克凋亡乳腺癌细胞负载的DC体内激发Th1型免疫反应
目的:探讨乳腺癌患者免疫热休克凋亡乳腺癌细胞负载的树突状细胞(DC)后体内免疫状态的变化,并对其安全性进行初步评估.方法:分离患者外周血单核细胞,用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和白介素-4(rhIL-4)诱导DC;将患者自体肿瘤细胞热休克后诱导其凋亡并负载自体DC.对10例确诊为乳腺癌的患者进行1个疗程(4次)的DC免疫治疗.结果:治疗中未出现明显不良反应,生活质量均有不同程度的改善,血清中IL-2、IL-12、IFN-γ和TNF-α水平治疗后呈明显上升趋势.结论:热休克凋亡乳腺癌细胞负载的DC体内可激发Th1型免疫应答,增强机体抗瘤能力,同时无明显毒副反应.
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HSPgp96与rIL-2治疗小鼠H22肝癌移植瘤的实验研究
目的:研究热休克蛋白gp96(Heat-Shock Protein gp96,HSPgp96)-肽复合物瘤苗与重组人白介素-2(Recombinant Human Interleukin-2 ,rIL-2)对小鼠H22肝癌移植瘤的治疗效果.方法:从H22肝癌细胞中提取和纯化HSPgp96.建立小鼠H22肝癌移植瘤模型,应用HSPgp96与rIL-2治疗并比较疗效,观察指标:瘤重,光镜、电镜下观察组织结构.结果:经鉴定获得纯化的HSPgp96 .HSPgp96 5μg与rIL-2 25ku治疗小鼠H22肝癌有效.结论:该实验方法提纯的HSPgp96与重组人IL-2都能有效抑制小鼠H22肝癌移植瘤的生长.
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嵌合抗原受体G250-CD8-28BBZ的构建及表达
目的 构建嵌合抗原受体G250-CD8-28BBZ的慢病毒表达质粒,并研究该嵌合抗原受体在T细胞中的表达.方法 利用常规分子克隆技术将编码Igκ信号肽、抗G250单链抗体及信号结构CD8-28BBZ的编码序列拼接起来,并将得到的融合基因片段插入慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreen中,采用酶切及测序鉴定.慢病毒感染T细胞后,通过荧光显微镜、Western blot、流式细胞术检测G250-CD8-28BBZ在T细胞中的表达.结果 双酶切及测序结果显示重组质粒pLVX-G250-CD8-28BBZ构建正确;慢病毒感染后的T细胞能发出绿色荧光;T细胞表达的G250-CD8-28BBZ分子大小正确;慢病毒感染2周后,G250-CD8-28BBZ在T细胞中的阳性表达率为45.2%.结论 成功构建了嵌合抗原受体G250-CD8-28BBZ的慢病毒表达质粒,该嵌合抗原受体能够在T细胞内高效稳定表达.
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自体胸水上清培养肿瘤浸润性淋巴细胞生长所需白细胞介素-2的适宜剂量
目的:模拟体内环境,摸索出应用自体胸水上清培养肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)时所需白细胞介素-2(IL-2)的适剂量. 方法:恶性胸水中的TIL经贴壁法分离后,分成A、B、C三组,分别应用含有细胞因子IL-2、CD3单克隆抗体(OKT3)及外源凝集素(PHA)的自体胸水上清进行培养,其中A组IL-2终浓度为6000u/ml;B组IL-2首剂终浓度为6000u/ml,其后换液时改为1000u/ml;C组IL-2终浓度为1000u/ml,比较不同剂量IL-2培养的TIL增殖速率、培养前后免疫表型变化和对自体肿瘤细胞的杀伤活性. 结果:培养的第3、7、14和21d检测发现,三组TIL均发生明显扩增,其中A、B两组间 TIL的生长速度无差异,但均明显快于C组; TIL免疫表型变化和对自体肿瘤细胞杀伤活性经组间比较无显著差异. 结论:TIL培养时,首剂IL-2的终浓度6000u/ml有着非常重要的意义,它有助于早期解除TIL的免疫抑制状态,使其在培养的第3d就发生明显的活化和扩增,为自体TIL体外分离后仅作短期培养即回输胸腔,后续胸腔内注入IL-2,使其进一步生长,发挥杀瘤效应,从而为治疗恶性胸水奠定了理论基础.
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自体胸腔积液上清作为培养液对肿瘤浸润淋巴细胞生长的影响
目的:观察自体胸腔积液上清作为培养液对肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)生长的影响. 方法:恶性胸腔积液中的TIL经贴壁法分离后,分别采用含有细胞因子白细胞介素-2(IL-2)、CD3单克隆抗体(OKT3)及植物血球凝集素(PHA)的自体胸腔积液上清及含10%人AB型血清的RPMI1640进行培养,比较两种培养液对TIL的增殖速度、培养前后免疫表型变化和对自体肿瘤细胞的杀伤活性. 结果:培养2周,经统计学比较发现,自体胸腔积液上清作为培养液对TIL的生长速度、免疫表型和对自体肿瘤细胞杀伤活性的影响与应用含10%人AB型血清的RPMI1640培养液培养无差异. 结论:自体胸腔积液上清作为培养液培养TIL是可行的.为自体TIL疗法治疗恶性胸腔积液提供理论基础.
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非甲基化CpG寡聚脱氧核苷酸对人乳头瘤病毒治疗性蛋白疫苗的免疫佐剂作用
目的 研究非甲基化CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)联合宫颈癌治疗性融合蛋白疫苗HPV16L2E6E7(以下简称蛋白疫苗)诱导小鼠产生的免疫应答及其在肿瘤免疫治疗中的免疫佐剂作用.方法 免疫学试验:108只雌性C57BL/6小鼠随机分成CpG组、蛋白疫苗组、CpG+蛋白疫苗组,每组36只,分别肌肉注射CpG-ODN(10μg/只)、蛋白疫苗(120 μg/只)、蛋白疫苗(120μg/只)和CpG-ODN(10 μg/只)的混合溶液,免疫程序为0、3、7 d;ELISPOT法检测IFN-γ,间接ELISA法检测IgG抗体水平,分别评价小鼠产生的细胞及体液免疫效果.肿瘤抑制试验:将40只雌性C57BL/6小鼠皮下接种TC-1肿瘤细胞(1×104/只),24h后随机分成4组接种疫苗,每组10只,CpG组、蛋白疫苗组和CpG+蛋白疫苗组分别肌肉注射CpG-ODN(10μg/只)、蛋白疫苗(120μg/只)、蛋白疫苗(120 μg/只)和CpG-ODN(10μg/只)的混合溶液,免疫程序为0、3、7d;对照组不给药.通过成瘤率分析抗肿瘤效果.结果 免疫学试验表明,免疫后14、21和28d,CpG+蛋白疫苗组小鼠分泌IFN-γ的T细胞高于蛋白疫苗组(Z=-2.36、-3.58、-3.58,P均＜0.05),在21 d达到高水平;免疫后5周,CpG+蛋白疫苗组IgG抗体滴度维持在1∶1×105左右,其中在10、14、21、42d与蛋白疫苗组比较差异显著(t=6.15、5.84、4.57、7.91,P均＜0.01);抑瘤试验表明,蛋白疫苗组能延缓肿瘤生长,成瘤率为40％,添加CpG-ODN后,成瘤率降为0(x2=5.00,P＜0.05).结论 将CpG-ODN与HPV16L2E6E7融合蛋白疫苗联合应用,可以诱导C57BL/6雌性小鼠产生更强的特异性体液和细胞免疫应答,对荷瘤鼠有更好的抗肿瘤效果,有望提高疫苗的免疫治疗效果.
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肿瘤免疫治疗相关毒性的识别和处理
近几年肿瘤免疫治疗明显延长了前列腺癌、黑色素瘤、肺癌患者的生存时间,但伴随出现的毒副反应需引起重视.不同类型的肿瘤免疫治疗药物的毒副反应谱不同,且在不同肿瘤患者中的毒性也不同.常见的毒副反应包括发热、乏力、皮疹、肝炎等.肿瘤免疫治疗所致的毒副反应可持续较长时间,因此建议患者在治疗开始直至治疗结束后的较长时间内密切监测其不良反应.虽然大多数肿瘤免疫治疗药物的毒副反应是可逆的,但严重的毒副反应可致死,因此需增加随访监测的频率以期早期识别,并立即积极处理.
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DC-CIK细胞临床制备规范化研究
树突状细胞(DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共培养,具有显著的协同抗肿瘤效应,逐渐成为肿瘤过继性细胞免疫治疗的首推方案.DC-CIK的协同抗肿瘤效应不仅在体外实验得到了证实,而且临床试验也证实了DC-CIK的强大抗肿瘤效应.然而目前国内外还没有关于DC-CIK细胞制备的统一技术规范,为此我们结合国内外知名实验室的制备经验,对DC-CIK细胞制备的技术规范进行探讨,以保证其临床应用的质量和安全.
关键词： 肿瘤免疫治疗 树突状细胞 细胞因子诱导的杀伤细胞 规范化 -
p53肽在肿瘤免疫治疗中的研究进展
体内外研究证实wtp53肽段可诱导特异性的CD8+T细胞和CD4+T细胞,因此,wtp53肽在肿瘤免疫治疗中得到广泛应用,并且,一些表位疫苗的抗肿瘤免疫治疗已进入Ⅰ、Ⅱ期临床研究.全文就近年来wtp53在肿瘤细胞中的免疫原性、新表位的确定以及这些新表位在临床肿瘤治疗中的作用进行阐述.
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OK432优化的内皮细胞疫苗抗小鼠乳腺癌作用研究
目的：探讨 OK432优化的人脐静脉内皮细胞( HU-VECs)疫苗对小鼠EAC乳腺癌的生长抑制作用。方法体外培养HUVECs,与佐剂OK432混合,制备HUVECs-OK432疫苗,以小鼠 EAC 乳腺癌皮下移植瘤模型考查 HUVECs-OK432疫苗的抗肿瘤效应,并通过ELISA、脾细胞增殖及细胞毒性T淋巴细胞( CTL)杀伤实验检测疫苗免疫后体液及细胞免疫应答水平。结果在预防性免疫中, HUVECs-OK432疫苗可以明显抑制EAC乳腺癌生长；HUVECs-OK432疫苗诱导小鼠产生了高滴度的特异性 HUVEC 抗体；HU-VECs-OK432疫苗能有效刺激免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖；HUVECs-OK432组小鼠脾细胞诱导产生了明显的靶向HU-VEC细胞的CTL杀伤作用。结论 HUVECs-OK432疫苗可以有效诱导机体产生靶向HUVEC的特异性体液及细胞免疫应答,从而有效抑制了小鼠EAC乳腺癌的生长。
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树突细胞疫苗在脑胶质细胞瘤免疫治疗中的作用研究进展
脑胶质细胞瘤是颅内常见的原发性肿瘤,占颅内原发性肿瘤的比率可高达40%[1]. 目前,临床上治疗主要为手术切除联合化学治疗和放射治疗,但该病复发率极高,且放射治疗和化学疗法所引起的副反应多,而且对机体的免疫系统损害非常大,严重影响患者的预后[2]. 胶质细胞瘤生长极其迅速. 文献资料[3]表明,高级别胶质瘤患者平均存活时间仅1.5年左右,2年生存率仅为25%~30%,而5年的生存率低于5%,所以,探索一种更为科学、有效的治疗策略意义重大. 近年来,肿瘤免疫治疗已经成为恶性肿瘤治疗的热点和发展方向,且现已进入临床研发阶段,目前被美国《科学》杂志评为2013年年度十大科学突破之首. 树突细胞作为具有人体强捕获抗原和递呈抗原的能力,在免疫治疗中起着至关重要的作用.
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穿膜肽介导 p53抗原多肽致敏 DC 的体外抗瘤效应
目的：探讨细胞穿膜肽（cpps）介导 p53致敏树突状细胞（DC）获得细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL），检测其体外对结肠癌细胞株的杀伤效果。方法抽取健康志愿者外周血50ml，用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，经细胞因子诱导，获得 DC 细胞和 T 淋巴细胞。将 Tat49－57－p53264－272致敏 DC 细胞，待 DC 细胞成熟后与 T 淋巴细胞混合诱导产生 CTL，并设 PBS 与 P53为对照。流式细胞术检测致敏前后 DC 细胞的表型，并采用乳酸脱氢酶（LDH）法检测抗原肽疫苗致敏 DC 后获得 CTL 对结肠癌细胞株 DLD1的体外杀伤活性，同时与人白血病细胞株 jurkat 的杀伤作用进行比较。结果致敏前 DC 中 CD80、CD86表达率分别为（15．9±2．1）％、（19．1±2．3）％，而致敏后分别为（17．4±1．7）％、（18．7±1．1）％，致敏前后比较差异无统计学意义，P ＞0．05。实验组穿膜肽可延长 p53抗原多肽在 DC 细胞内半衰期，从而增强与 DC 细胞质内的 MHC I 类分子的结合率，并提呈到细胞表面。实验组 CTL 对结肠癌 DLD1细胞的杀伤能力显著强于对照组，且随着效靶比的增加，杀伤活性逐渐增强（P ＜0．05）。 Tat49－57－p53264－272多肽致敏 DC 活化 CTL 对 DLD1细胞具有特异性杀伤作用，对 DLD1的杀伤作用显著强于 jurkat 细胞（P ＜0．05）。结论穿膜肽可以增强 p53抗原多肽的免疫原性，Tat49－57－p53264－272多肽致敏 DC 能有效诱导抗结肠癌 DLD1细胞的特异性免疫应答。
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肿瘤免疫治疗研究进展
免疫系统的功能状态在肿瘤的发生、发展中起到重要作用,对于肿瘤的发生、发展及预后具有重要的影响.基于肿瘤抗原的存在,机体针对肿瘤抗原具有免疫应答,包括特异性和非特异性免疫.然而,肿瘤抗原具有免疫原性低,肿瘤细胞存在免疫逃逸现象,肿瘤患者机体产生的免疫应答常不能抑制肿瘤生长,例如肿瘤抗原的缺失、主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)类分子表达低下、共刺激信号异常、肿瘤形成过程中产生或分泌的免疫抑制因子(TGF-β、IL-10、IL-33等)以及肿瘤微环境中各种免疫抑制性细胞,包括骨髓来源的抑制性细胞(myeloid derived suppressor cells,MDSC)和调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)等[1].
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Exosomes的生物学特性及抗肿瘤作用研究现状
早在1981年,Trams等[1]在正常细胞和肿瘤细胞的培养上清液中发现并描述了1种囊泡结构,6年后Johnstone等[2]从网织红细胞的培养上清液中分离纯化了这种囊泡状沉淀物,并命名为Exosomes.但直到近几年有关Exosomes基础与临床的研究才得到更多的关注,这主要归因于它在抗肿瘤方面有着广阔的开发前景.现综述如下.
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人4-1BBL胞外区蛋白的生物学活性研究
目的 研究人4-1BBL胞外区蛋白与4-1BB表达阳性细胞的结合与激活活性.方法 采用酶联免疫吸附分析人4-1BBL胞外区蛋白与A549细胞的结合活性,并进一步采用免疫组化分析人4-1BBL胞外区蛋白与4-1BB阳性细胞的结合活性,然后研究人4-1BBL胞外区蛋白对Jurkat细胞IL-2释放的影响.结果 4-1BBL胞外区蛋白能与4-1BB表达阳性的A549细胞系以及激活的Jurkat细胞特异性结合,并能维持激活的Jurkat细胞释放IL-2.结论 所获得的人4-1BBL胞外区蛋白具有结合与激活双重活性,在肿瘤及其他免疫性疾病的治疗中具有潜在的应用前景.
