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Hiwi基因在膀胱移行细胞癌组织切片中的表达
目的 检测Hiwi基因在膀胱移行细胞癌组织切片中的表达情况.方法 应用免疫组织化学方法,对Hiwi基因在膀胱癌组织切片中的表达情况进行检测.结果 Hiwi蛋白表达的阳性细胞百分率在不同临床分期的膀胱移行细胞癌即浅表性膀胱癌(Tis、Ta、T1)和浸润性膀胱癌(T2、T3、T4)之间存在显著性差异,(P<0.01).Hiwi蛋白的阳性表达率随病理级别增高而递增,不同病理分级(G1、G2和G3)之间存在显著性差异,(P<0.01).结论 Hiwi基因可能成为膀胱癌一个潜在的基因治疗靶点,并作为基因治疗靶点的体外实验研究提供了实验基础.
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HIWI基因沉默对膀胱癌细胞生物学行为的影响
目的:利用基因转染和RNA干扰(RNAi)技术,研究HIWI基因沉默对T24细胞生物学行为的影响,探讨HIWI基因作为抑制膀胱癌细胞增殖分子靶点的可能性.方法:实验分为转染pGenesil-2-HIWI1组、转染pGenesil-2-HIWI2263组、转染阴性对照质粒pGenesil-2-control组,只加转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)的对照组和只加入PBS的阴性对照组,每组设4个平行样.利用PEI介导,将靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体瞬时转染T24细胞,通过MTT法及流式细胞仪检测各组细胞增殖和细胞周期的改变.结果:转染后24 h,转染组的细胞增殖抑制率分别为32.60%和26.09%,较对照组细胞增殖抑制率(3.54%)明显降低(P＜0.01).转染后48 h,转染组S期细胞百分数[(29.39±3.27)%和(30.87±10.88)%]较对照组[(39.36±2.09)%]明显降低,G2/M期细胞百分数[(9.39±0.80)%和(11.46±1.53)%]较对照组[(5.57±0.40)%]明显增加(P＜0.05).结论:HIWI基因沉默对T24细胞具有增殖抑制作用,HIWI基因可以作为抑制膀胱癌细胞增殖的分子靶点;HIWI基因沉默对膀胱癌具有潜在的治疗价值.
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Hiwi基因靶向沉默对乳腺癌MCF-7/ADM细胞化疗敏感性的影响
目的:探讨耐阿霉素乳腺癌MCF-7/ADM细胞应用Hiwi基因靶向沉默技术后对阿霉素敏感性的变化,阐明Hiwi基因在乳腺癌MCF-7/ADM细胞耐药机制中的作用.方法:MCF-7/ADM 细胞分为对照组、Hiwi siRNA1组和Hiwi siRNA2组,分别转染Hiwi control、Hiwi siRNA1和Hiwi siRNA2 3种不同载体,应用实时定量PCR和Western blotting法检测Hiwi基因mRNA和蛋白表达水平,判断转染效率.转染后各组乳腺癌MCF-7/ADM细胞加入不同浓度阿霉素(0、0.1、0.5和1.0 mg·L-1),0 mg·L-1 阿霉素组为对照组,采用MTT法检测各组MCF-7/ADM细胞的存活率,即耐药敏感性.结果:与对照组比较,转染后Hiwi siRNA1和Hiwi siRNA2组细胞中Hiwi基因mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P<0.01).与对照组比较,经不同浓度阿霉素作用后,Hiwi siRNA1组和Hiwi siRNA2组细胞存活率明显降低(P<0.01),阿霉素浓度为1.0 mg·L-1时,2组细胞存活率分别为(48.15±6.28)%和(41.73±6.17)%,对阿霉素的敏感性明显增强.结论:Hiwi基因在MCF-7/ADM细胞中具有高效的靶向沉默,Hiwi基因沉默后的MCF-7/ADM细胞对阿霉素恢复敏感性.
关键词： 乳腺肿瘤 Hiwi基因 靶向沉默 MCF-7/ADM细胞 敏感性 -
利用Gateway克隆技术构建人Hiwi腺病毒载体
目的：获得人的全长 Hiwi编码区基因，构建携带绿色荧光蛋白（GFP）的人 Hiwi腺病毒载体，为进一步研究 Hiwi诱导白血病干细胞分化和凋亡的作用和机制奠定基础。方法：运用重叠延伸 PCR方法扩增Hiwi编码区基因全长；利用 Gateway克隆技术将 Hiwi编码区基因全长插入带有 GFP的载体 Flag-IRES-hrGFP中构建成为 pDown-Hiwi-3× flag-IRES-hrGFP，再将克隆载体 pDown-Hiwi-3× flag-IRES-hrGFP 与表达载体pAV.Des1d进行同源重组反应，得到重组腺病毒载体 pAV.Ex1d-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP。经 PCR筛选阳性克隆提取重组腺病毒质粒，包装成重组Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP腺病毒。结果：人 Hiwi全长编码区基因克隆成功，经酶切及基因测序鉴定证实重组 Ad-Hiwi-3× flag-IRES-hrGFP 腺病毒质粒构建成功。采用Lipofectamine法将 Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP转染入 HEK293A细胞中，在荧光显微镜下，可以观察到转染细胞中的绿色荧光。结论：成功构建重组 Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP腺病毒质粒，其可在 HEK293A细胞内表达。
关键词： Hiwi基因 腺病毒 重叠延伸聚合酶链反应 Gateway克隆技术 -
人Hiwi miRNA干扰质粒的构建及其鉴定
目的 构建人Hiwi基因miRNA干扰质粒,探讨其对肝癌7721细胞株中Hiwi基因和蛋白表达的阻抑作用.方法 根据Homo sapiens Hiwi基因序列,设计RNA干扰靶点,构建4对Hiwi的pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR miRNA及1对无效对照miRNA干扰质粒并将其转染至肝癌7721细胞中,通过RT-PCR和Western blot检测7721细胞中Hiwi mRNA和蛋白的表达水平.结果 成功构建了4对Hiwi miRNA干扰质粒及无效干扰质粒,测序表明Hiwi干扰序列及读框完全正确.RT-PCR和Western blot结果显示,与未转染组及阴性对照组比较,转染该载体能有效下调7721细胞株中mRNA和蛋白的表达.结论 成功构建了Hiwi的干扰表达载体,为进一步探讨Hiwi基因在肝癌中的相关机制提供了实验基础.
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Hiwi基因在肝癌组织中的表达
目的 研究Hiwi基因mRNA及Hiwi蛋白在肝癌组织中的表达.方法 92例肝癌及癌旁组织标本,应用RT-PCR、Western blot及免疫组化方法分别检测肝癌和癌旁组织中Hiwi基因mRNA及蛋白的表达.结果 肝癌组织Hiwi基因mRNA和Hiwi蛋白表达量显著高于癌旁组织(P＜0.05).Hiwi蛋白主要在肿瘤和癌旁组织细胞胞浆中呈阳性表达.肝癌组织中Hiwi阳性表达率为65.2%(60/92),显著高于癌旁组织的27.2%(25/92)(P＜0.05).结论 Hiwi基因mRNA及蛋白在肝癌组织中均呈高表达,可能在肝癌的发生、发展过程中起重要作用.
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靶向Hiwi基因的siRNA干扰对诱导三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响
目的:探讨干扰Hiwi基因对三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡的影响.方法:培养并转染三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231,按照实验设计分为6组,转染后应用qRT-PCR、Western blot分析Hiwi基因的mRNA及其靶蛋白的表达情况,根据结果评估干扰效果筛选有效的siRNA干扰片段作为干扰组(Hiwi10330组),再按照试验设计分为3组分别是干扰组,阴性对照组(NC组)、空白对照组(Blank组),在细胞转染后进行细胞流式检测各实验组细胞凋亡率.结果:靶向Hiwi基因的siRNA干扰后,干扰组中mRNA的表达量明显降低(P<0.05),Hiwi基因靶蛋白的表达也出现了明显的抑制(P<0.05).靶向Hiwi基因的siRNA干扰后,干扰组MDA-MB-231细胞的凋亡率与NC和Blank组相比明显升高(P<0.05).结论:siRNA靶向沉默Hiwi基因后,乳腺癌细胞MDA-MB-231的凋亡率明显升高,提示Hiwi基因可能成为三阴乳腺癌的一潜在治疗靶点.
