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TAGLN真核表达载体pcDNA6.2/EmGFP-Bsd/V5-TAG-LN-mut及稳定转染细胞株的构建
目的:构建携tagln基因的真核表达载体,建立稳定转染该质粒的人结肠癌细胞株RKO并鉴定.方法:通过Gateway克隆技术,使用pOTB7-TAGLN-mut与pDONR221进行BP重组反应,产生入门克隆,再与pcDNA6.2/EmGFP-Bsd/V5-DEST空载体进行LR重组反应,生成目的质粒pcDNA6.2/EmGFP-Bsd/V5-TAGLN-mut.通过测序验证目的质粒的插入序列.将携带tagln的真核表达载体和对照质粒稳定转染至人结肠癌细胞株RKO.通过实时荧光定量PCR和免疫印迹检测tagln的mRNA和蛋白表达水平.通过细胞侵袭实验了解transgelin在结肠癌细胞RKO中的作用.结果:携带tagln的真核表达载体测序分析显示插入序列及位点正确；实时荧光定量PCR及免疫印迹结果显示,稳定转染重组目的质粒的细胞株(RKO-TAGLN细胞)中tagln的表达水平与转染对照质粒的细胞株(RKO-CTRL细胞)及野生型RKO细胞相比明显上调,差异具有统计学意义(mRNA相对表达水平分别为45.58±12.79、1.32±0.43和1,P＜0.01；蛋白质灰度定量值为1.69±0.04、0.29±0.05和0.29±0.04,P＜0.01).细胞侵袭实验提示,RKO-TAGLN细胞较RKO-CTRL细胞的侵袭能力提高(161.76％±61.18％,P＜0.01).结论:成功构建携tagln基因的真核表达载体并建立过表达transgelin的稳定细胞株和对照细胞株,为研究transgelin在结肠癌中的作用奠定基础.
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利用Gateway克隆技术构建人Hiwi腺病毒载体
目的：获得人的全长 Hiwi编码区基因，构建携带绿色荧光蛋白（GFP）的人 Hiwi腺病毒载体，为进一步研究 Hiwi诱导白血病干细胞分化和凋亡的作用和机制奠定基础。方法：运用重叠延伸 PCR方法扩增Hiwi编码区基因全长；利用 Gateway克隆技术将 Hiwi编码区基因全长插入带有 GFP的载体 Flag-IRES-hrGFP中构建成为 pDown-Hiwi-3× flag-IRES-hrGFP，再将克隆载体 pDown-Hiwi-3× flag-IRES-hrGFP 与表达载体pAV.Des1d进行同源重组反应，得到重组腺病毒载体 pAV.Ex1d-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP。经 PCR筛选阳性克隆提取重组腺病毒质粒，包装成重组Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP腺病毒。结果：人 Hiwi全长编码区基因克隆成功，经酶切及基因测序鉴定证实重组 Ad-Hiwi-3× flag-IRES-hrGFP 腺病毒质粒构建成功。采用Lipofectamine法将 Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP转染入 HEK293A细胞中，在荧光显微镜下，可以观察到转染细胞中的绿色荧光。结论：成功构建重组 Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP腺病毒质粒，其可在 HEK293A细胞内表达。
关键词： Hiwi基因 腺病毒 重叠延伸聚合酶链反应 Gateway克隆技术
