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土壤中产壳聚糖酶真菌的筛选
在以壳聚糖(Chitosan)为唯一碳源和氮源的培养基上,利用透明圈筛选法,从不同地区采集的105份土样中,共分离到26株产生透明圈较大的菌株,结合酶活力测定结果,获得产酶能力较高的菌株HF-1、HF-5,为进一步的研究提供了条件.
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海洋寡糖工程药物--壳寡糖制备分离新工艺及其抗癌活性研究
以海洋甲壳多糖为原料,研究了酶法解制备壳寡糖的方法,通过对专一性和非专一性降解用酶的筛选,确定以壳聚糖酶或6036酶为降解酶;考察了底物浓度、酶量、温度、pH、溶解介质等因素对降解反应的影响;提出了反应与分离相耦合制备壳寡糖的新构思;在此基础上进行了扩大试验,确认了该过程实现工业化生产的可行性.对所生产壳寡糖的抑瘤活性研究证明一定结构的壳寡糖具有很好的生物活性,具有开发抗肿瘤药物前景.
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青霉菌产壳聚糖酶制备低分子量壳聚糖的研究
利用Penicillium sp.ZD-Z1发酵培养生产壳聚糖酶,研究其降解特性,并制备特定低分子量的壳聚糖.结果表明,在30℃、pH 5、加内切酶ChA0.01u/ml的条件下降解4%壳聚糖,通过MHS方程η=1.02×10-4Mw1.27控制反应时间,可以得到低分子量的壳聚糖.
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青霉菌产壳聚糖酶的分离纯化及性质研究
青霉菌(Penicilium sp.)发酵液经20%～70%硫酸铵分级沉淀,DEAE-Cellulose离子交换层析,Sephadex G-100凝胶过滤层析,得到聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的壳聚糖酶,比活力1020 u/mg,纯化182倍.其分子量为30 kD,酶的适温度和pH分别为50°C和5.0,金属离子Mg2+和Ca2+对酶活力有一定的促进作用,重金属离子Cu2+、Ni2+和Zn2+对酶有较强的抑制作用.该壳聚糖酶具有很强的底物专一性,动力学参数Km值为2.601 g/L.
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壳聚糖酶的纯化、基因克隆、及其酶学特性的鉴定
从被污染的酵母培养液中分离到-菌株,经鉴定为一种革兰氏阳性杆菌,其所分泌的主要蛋白产物经纯化后,测定了它的N-端氨基酸序列,与已知的几种内切壳聚糖酶十分类同.根据其同源DNA序列,通过PCR方法克隆了其全长基因.该菌株生长极快,其组成型分泌产物主要为内切壳聚糖酶.该酶通过疏水层析和分子筛两步即得到纯化.进一步研究了该酶的酶学性质及其催化壳聚糖降解为壳寡糖的条件.提高该壳聚糖酶的产率后,有望用于壳寡糖的生产,有实际应用价值.
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壳聚糖酶基因在软骨细胞中的表达及对壳聚糖介导基因转染的影响
[目的]探讨携带壳聚糖酶(CSN)基因的重组慢病毒感染软骨细胞后影响CSN活性的因素,及CSN在壳聚糖(CS) /DNA纳米粒介导基因转染软骨细胞中的作用.[方法]构建携带CSN和红色荧光带白(RFP)基因的重组慢病毒(LV-CSN)并感染兔关节软骨细胞,流式细胞仪及荧光显微镜检测其感染率;二硝基水杨酸比色法(DNS)检测对CSN活性的影响因素;以CS/DNA纳米粒介导体外基因转染软骨细胞,检测CSN对CS/DNA纳米粒介导基因转染软骨细胞的作用.[结果]带RFP基因的LV-CSN感染软骨细胞后48 h和第7d,RFP表达率分别为(91.40±0.98)％和(91.67 ±1.00)％,二者差异无统计学意义(P=0.583).pH值、温度及铜离子浓度对CSN的活性有明显影响.LV-CSN感染软骨细胞后CS/DNA组的基因转染效率显著高于裸pDNA组和CS/DNA组(P＜0.05),但铜离子可以拮抗这种作用.[结论]在一定时间内LV-CSN感染软骨细胞后可稳定表达CSN,CSN的活性受pH值、温度及铜离子浓度的影响;CSN可提高CS/DNA对软骨细胞的基因转染效率,铜离子则可拮抗这种作用.
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1株壳聚糖酶产生菌的鉴定和产酶条件优化
目的 对产壳聚糖酶菌株Y116进行菌种鉴定,并提高菌株Y116壳聚糖酶的产量.方法 对产壳聚糖酶菌株Y116进行了形态学观察、生理生化特征鉴定和16S rDNA序列同源性分析;采用单因素法和响应面法,对菌株Y116产酶的培养基成分和培养条件进行优化.结果及结论 菌株Y116归属于芽孢杆菌属(Bacil-lus sp.).单因素实验中,酶活力达到高值时各因素的数值分别为:乳糖35 g/L,豆饼粉30 g/L,Mg2+2 mmol/L,NaCl 5 g/L,初始pH 5.0,接种量5％,培养温度30℃和发酵时间96 h.利用Plackett-Burman(PB)设计对影响壳聚糖酶产量的8个主要因素进行评价,确定了豆饼粉浓度、初始pH和Mg2+浓度是影响菌株产酶量的3个主要因素;利用中心组合设计(CCD)及响应面分析,终得到3个主要因素的优值:豆饼粉浓度39.43 g/L,pH 5.94,Mg2+浓度2.05 mmol/L,酶活力比优化前提高了5倍.复使用10次后,其相对酶活仍为42.3％,说明具有良好的批次操作稳定性.该酶经过固定化后热稳定性和pH稳定性均得到了提高.
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壳聚糖酶的研究进展
壳聚糖酶是1种催化降解壳聚糖的专一性糖苷水解酶.基于近年来国内外壳聚糖酶的研究成果,本文对壳聚糖酶的来源与性质、发酵生产和分离纯化、重组表达与工程化研究及其应用开发进行了综述,探讨了壳聚糖酶研究中存在的问题及今后的研究方向,为其进一步开发利用提供参考.
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假单胞菌产壳聚糖酶突变菌株的筛选
以假单胞菌Y1为出发菌株,分别通过亚硝基胍(NTG),Co60,UV(紫外)诱变,采用透明圈法筛选,获得了产壳聚糖酶较好的突变菌株假单胞菌Y8,其所产酶活力达到3.0 U·ml-1,酶活力提高近6倍,并具有较好的遗传稳定性.3种诱变方法中,UV诱变效果好.
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小球藻病毒PBCV-1溶壁活性研究
目的:了解小球藻病毒PBCV-1侵入小球藻NC64A细胞的溶壁活性.方法:通过已建立的Lysin-NC64A细胞壁消解敏感指示系统,进行PBCV-1病毒颗粒溶壁酶活的检测;应用冻融实验比较各种酶在溶壁过程中的作用.结果:PBCV-1病毒颗粒具有降解宿主细胞壁的活性,参与其溶壁活性的酶是几丁质酶、壳聚糖酶和β-1,3-葡萄糖苷酶,其中壳聚糖酶的活力高低并不与其裂解活性成正比.结论:几丁质酶可能在PBCV-1病毒侵入及释放过程中起主要作用,而壳聚糖酶只作为一个辅助成分.
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壳聚糖酶的毒理学安全性评价
目的 通过研究壳聚糖酶的急性经口毒性试验、遗传毒性试验和亚慢性毒性试验,对其安全性进行研究和评价,为其合理开发及利用提供科学依据.方法 根据GB15193-2003食品安全性毒理学评价程序和方法,采用急性经口毒性试验、3项遗传毒性试验(Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验及小鼠精子畸形试验)、90d喂养试验对壳聚糖酶的毒理学安全性进行研究和评价.结果 壳聚糖酶对昆明种小鼠的大耐受剂量大于20.0 g/kg· bw;3项遗传毒性试验结果均为阴性;以0.2 g/kg·bw、0.4g/kg· bw和0.6g/kg· bw剂量的壳聚糖酶给予SD种大鼠连续灌胃90 d,将各剂量组的体重、增重、食物利用率、血液学指标、脏器重量及脏器/体重比值与对照组进行统计学分析,结果其差异无统计学意义(P＞0.05),大体解剖和组织病理学检查未见与样品有关的异常改变.结论 根据GB15193-2003食品安全性毒理学评价程序和方法的要求和标准,在本实验室条件下,壳聚糖酶的大耐受剂量大于20.0 g/kg·bw,属无毒物,无遗传毒性,其90d喂养试验的未观察到有害作用剂量(NOAEL)为0.6 mg/kg·bw.
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固态发酵黑曲霉产壳聚糖酶的纯化及其性质研究
目的 研究黑曲霉产壳聚糖酶的纯化及其性质.方法 紫外诱变筛选黑曲霉产壳聚糖酶高产菌株,并分离纯化其固态发酵物的粗提液,研究纯化的壳聚糖酶的酶学性质.结果 固态发酵120 h,干培养基的酶活力可达58.12 U·g~(-1).固态培养基提取液通过丙酮分级沉淀,经交联壳聚糖树脂亲和层析、DEAE-Sepharose FF层析得到了一种胞外壳聚糖酶,分子量为63kD,适反应温度为55℃,适反应pH6～7,降解壳聚糖反应的米氏常数K_m为2.933 g·L~(-1),V_(max)为0.028 g·L~(-1)·min~(-1).该酶不能降解片状甲壳素和纤维素,能微弱降解CMC和胶体甲壳素,适底物为脱乙酰度90%的胶体壳聚糖.结论 紫外诱变的成本低、方法简单,利用黑曲霉高产壳聚糖酶菌株发酵能生产一种新型壳聚糖酶.
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壳聚糖酶的研究进展
目的 壳聚糖的降解产物壳寡聚糖在医药领域中有着广泛的应用前景,而壳聚糖酶是酶法制备壳寡聚糖的专一性酶.本文综述了壳聚糖酶的研究概况,主要是壳聚糖酶的酶学特性、分离纯化以及分子生物学研究进展,同时展望了其应用前景.
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金龟子绿僵菌固态发酵生产壳聚糖酶优化工艺的研究
目的 研究一种绿僵菌固态发酵产壳聚糖酶的新方法.方法 使用正交实验方法研究以日本根霉液态发酵后的菌丝体粉末为氮源,麸皮为碳源时,绿僵菌固态发酵产壳聚糖酶的佳条件.结果 在起始pH5.0,27℃下培养120 h,C/N为l:4、固液比为1:1.4,绿僵菌发酵产壳聚糖酶活性高.在优化的条件下,固态发酵产壳聚糖酶的大活性可达35.08 U/g干培养基.
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固态发酵贵州绿僵菌产壳聚糖酶的亲和层析纯化及其性质研究
目的 寻找壳聚糖酶新酶源并简化壳聚糖酶纯化工艺.方法 将贵州绿僵菌固态发酵物粗提液经交联壳聚糖树脂层析,以5‰Cu2+洗脱,洗脱液透析浓缩后经Superdex75层析.结果 该菌株在发酵120 h时,每克干培养基酶活力可达(83.09±2.9) U.经亲和层析和分子筛分离可获得电泳纯的壳聚糖酶,酶活力回收率为43.52%.每克干培养基可获壳聚糖酶328 μg,比活达106.39 U/mg.酶蛋白相对分子质量为50.3×103.结论 固态发酵贵州绿僵菌生产壳聚糖酶可作为壳聚糖酶的新酶源.用交联壳聚糖树脂亲和层析、Cu2+洗脱和分子筛分离的方法可以纯化壳聚糖酶.
