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人卵巢颗粒细胞分离培养方法的改进
背景：建立分离培养颗粒细胞快速有效的方法也是提高体外受精-胚胎移植成功率关键的一步。虽然目前文献中有较多关于人卵巢颗粒细胞分离方法的报道，但在细胞数量、纯度及后续生长等方面不尽人意。目的：建立有效的分离提纯、体外培养人卵巢黄素化颗粒细胞的方法。方法：收集体外受精-胚胎移植取卵时的卵泡液，用裂解法、沉淀法、密度梯度离心法分离，Ⅰ型胶原酶或透明质酸酶消化颗粒细胞黏液团并接种在培养皿中进行培养，培养液中加入或不加自体卵泡液。结果与结论：用裂解法得到的颗粒细胞数较沉淀法和密度梯度离心法得到的细胞数多(P >0.05，P <0.05)；3种方法提取的颗粒细胞活性比较无明显差异；培养24 h后沉淀法贴壁细胞数多(P <0.05)，而密度梯度离心法贴壁细胞数少(P <0.05)；透明质酸酶消化颗粒细胞较Ⅰ型胶原酶耗时少且消化彻底；加入自体卵泡液能够促进颗粒细胞生长和存活。结果证实，沉淀法提取颗粒细胞虽然耗时长，但培养的细胞存活率高、培养后收获的细胞数多；透明质酸酶较Ⅰ型胶原酶更适合消化颗粒细胞黏液团；在培养液中加入自体卵泡液更有益于颗粒细胞生长。
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人脂肪干细胞的提取和鉴定
背景：脂肪干细胞是存在于脂肪中的全能干细胞，具备自我更新能力与多向分化潜能，遗传背景相当稳定，体内植入后免疫排斥少，是一种比较理想的种子细胞。目的：提取人大网膜脂肪干细胞，并进行成脂和成骨分化能力鉴定。
方法：收集手术患者大网膜的脂肪组织，经Ⅰ型胶原酶消化、过滤、离心后进行原代培养，观察细胞生长状态；用细胞计数法绘制人脂肪干细胞增殖曲线，计算处于对数生长期的倍增时间；用相应的定向诱导液诱导人脂肪干细胞向脂肪细胞及骨细胞方向分化，并用油红O染色、茜素红染色进行鉴定。
结果与结论：从手术患者大网膜脂肪组织中成功分离人脂肪干细胞，贴壁生长的人脂肪干细胞为长梭形，形态类似成纤维细胞。第3代人脂肪干细胞生长曲线呈S形，对数生长期人脂肪干细胞的倍增时间为45.90 h。人脂肪干细胞经成脂、成骨定向诱导分化2，3周后，油红O染色显示细胞内有大小不等的橘红色脂肪滴，茜素红染色可见着橘红色的典型钙化结节，提示所培养的脂肪干细胞具有向脂肪细胞、骨细胞系分化的能力。 -
5-氮杂胞苷联合血管紧张素Ⅱ诱导脂肪间充质干细胞向心肌细胞的分化
背景:采取有效措施修复坏死心肌成为临床治疗心肌梗死的新方向.目的:探讨5-氮杂胞苷联合血管紧张素Ⅱ对小鼠脂肪间充质干细胞向心肌细胞分化的影响.方法:取20只4周龄ICR小鼠,利用Ⅰ型胶原酶消化法获得脂肪间充质干细胞,观察细胞的形态学特点,运用MT-T-法检测细胞的增殖情况,运用免疫荧光技术检测细胞表面抗原CD90,CD105,CD73,CD45的表达.第4代脂肪间充质干细胞培养24 h后,更换为含15 μmol/L 5-氮杂胞苷和15 μmol/L 5-氮杂胞苷+0.1 μmol/L血管紧张素Ⅱ的培养基诱导24 h,然后更换为完全培养基,Western Blot检测细胞中cTnT蛋白表达.结果与结论:①原代脂肪间充质干细胞胞核较小,呈梭形、星形,传代后细胞体积增大,形态趋于一致,排列规则;②第3代小鼠脂肪间充质干细胞的生长曲线呈现“S”形,第1-3天为潜伏期,第4天进入对数生长期,第5-7天细胞生长达到峰值,进入平稳期;③第4代脂肪间充质干细胞表面CD90、CD105及CD73呈阳性表达,CD45阴性表达;④5-氮杂胞苷联合血管紧张素Ⅱ组心肌细胞中cTnT蛋白表达量显著高于5-氮杂胞苷(P＜0.05);⑤结果表明,5-氮杂胞苷联合血管紧张素Ⅱ能够显著促进脂肪间充质干细胞向心肌细胞样细胞分化.
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两种软骨终板细胞体外培养方法效果的比较研究
目的 比较原代椎间盘软骨终板细胞实验室培养中Ⅰ型与Ⅱ型胶原酶消化效率的差异.方法 提取新西兰大白兔椎间盘软骨终板组织,将其剪碎并随机分成2等份,标记为Ⅰ型胶原组和Ⅱ胶原型组;用0.25％的胰蛋白酶预消化后,分别用0.02％Ⅰ型胶原酶和0.02％Ⅱ型胶原酶在37 cc消化3次,每次lh;将3次消化所得的细胞悬液混匀后离心,获取细胞并进行培养与传代;对两组软骨终板细胞分别进行细胞计数、细胞形态学观察和细胞增殖情况检测等处理,比较两组软骨终板细胞数目、形态及增殖情况的差异.结果 1)细胞计数:Ⅰ型胶原组细胞3次细胞计数结果分别为5.75×104个/mL、5.50×104个/mL、6.25×104个/mL,获得软骨终板数目(5.83±0.31)×104个/mL;Ⅱ胶原型组细胞3次细胞计数结果分别为8.75×104个/mL、9.50×104个/mL、8.25×104个/mL,获得软骨终板数目(8.83±0.51)×104个/mL,Ⅰ型胶原组细胞总量明显少于Ⅱ胶原型组;2)细胞形态:两组软骨终板细胞多呈多角形,胞核大而圆,形态无明显差异.3)细胞增殖:Ⅰ型胶原组细胞MTT读数OD值为(0.561±0.003),Ⅱ胶原型组细胞MTT读数OD值为(0.562±0.002),组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 Ⅱ型胶原酶较Ⅰ型胶原酶更适用于原代椎间盘软骨终板细胞的分离培养.
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Ⅰ型胶原酶消化组织块法体外培养人牙髓细胞
目的建立利用Ⅰ型胶原酶消化组织块体外培养人牙髓细胞方法.方法通过组织块Ⅰ型胶原酶消化法进行人牙髓细胞体外培养,免疫细胞化学法鉴定细胞组织来源,进行细胞传代,酶组织化学法对体外复层生长的人牙髓细胞爬片进行碱性磷酸酶组织化学染色,并检测其矿化能力.结果采用Ⅰ型胶原酶消化组织块法体外培养的原代牙髓细胞,在第15～20 d出现汇合,第4～6代牙髓细胞在连续培养后具有复层生长特性,并具有显著的碱性磷酸酶活性,阳性染色强弱部位呈区域性分布,连续培养的牙髓细胞可形成矿化结节.结论Ⅰ型胶原酶消化组织块法可以很好地进行人牙髓细胞体外培养,可以用酶组织化学法研究牙髓细胞的生物学特性.
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胶原酶分离及低速离心结合筛网过滤法纯化子宫内膜细胞的研究
目的:探索分离子宫内膜细胞以及纯化子宫内膜腺上皮细胞与间质细胞的佳方法.方法:采用Ⅰ型胶原酶、胰酶、Ⅰ型胶原酶混合胰酶以及机械研磨等4种方法处理大鼠子宫,比较细胞数和活细胞率,从而获得分离子宫内膜组织的佳方法.用获得的佳方法分离人类子宫内膜组织,比较采用2次筛网过滤(筛网法)和低速离心结合筛网过滤(结合法)进一步纯化子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞获得的细胞数和纯化效率,从而获得较好的纯化方法.结果:Ⅰ型胶原酶、胰酶、Ⅰ型胶原酶混合胰酶和机械研磨处理大鼠子宫组织所得的细胞数分别为6.43±3.55×105/ml、4.59±2.35×105/ml、4.25±1.06×105/ml、3.57±1.15×105/ml,差异有统计学意义(P＜0.05);活细胞率分别为98.90±0.74％、96.63±1.84％、97.97±2.02％、97.20±4.41％,差异无统计学意义(P＞0.05).筛网法和结合法纯化分离所获得的腺上皮细胞数为0.43±0.21×l05/ml、8.27±2.46×10 5/ml;间质细胞纯度为92.94±2.89％和99.19±0.24％,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:Ⅰ型胶原酶是分离子宫内膜细胞的佳方法,而采用低速离心结合筛网过滤法是较理想的纯化分离后的子宫内膜细胞的方法.
