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高效液相色谱法同时测定小鼠肝脏中S-腺苷甲硫氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸
目的 建立同时测定小鼠肝脏中S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)的高效液相色谱法(HPLC).方法 小鼠肝脏称重,用手持匀浆器快速乳化肝脏,再加4倍体积的0.6 mol/L高氯酸超声,离心取上清液过膜,以50 mmol/L NaiH2PO4缓冲液、10 mmol/L庚烷磺酸钠和20％ (V/V)甲醇为流动相,选用Venusil MP-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)柱进行色谱分离,流速1.0 ml/min,柱温30℃,UV检测波长254 nm.结果 SAM和SAH在检测范围内浓度与峰面积线性关系良好(r ＞0.9990);平均回收率92.20％～101.38％,相对标准偏差(RSD) 2.88％ ～6.78％.SAM和SAH平均日内精密度为4.14％和3.71％,平均日间精密度为7.51％和9.54％.小鼠肝脏中SAM和SAH的含量分别为3.14 ～ 6.09 mg/L(31.44 ～60.98 nmol/g肝湿重)和1.29 ～3.10 mg/L(13.38 ～32.17 nmol/g肝湿重).结论 HPLC适用于小鼠肝脏中SAM和SAH的含量检测,方法简便,结果可靠.
关键词： 高效液相色谱法 S-腺苷甲硫氨酸 S-腺苷同型半胱氨酸 肝脏 小鼠 -
高效液相色谱法同时测定血浆中S-腺苷甲硫氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸
目的 建立同时测定血浆中S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)的高效液相色谱分析方法,并对正常人血浆中的含量进行测定.方法 样品用400g/L三氯乙酸处理,离心取上清液过膜,以50mmol/L NaH2 PO4缓冲液(pH4.38)、庚烷磺酸钠和甲醇为流动相,选用Venusil MP-C18 (4.6mm×250mm,51μm)色谱柱进行色谱分离,流速为1.0ml/min,柱温30℃,紫外检测波长254nm.结果 SAM和SAH在相应检测浓度范围内与其响应值呈良好的线性关系(r＞0.9999)；方法回收率在94.14％ ～ 102.44％,相对标准偏差在1.00％～ 8.10％.正常人血浆中SAM和SAH的含量分别为0.032 ～0.080mg/L和0.004 ～0.010mg/L.结论 该方法用于血浆中SAM和SAH的检测简便快速,准确可靠.
关键词： 高效液相色谱法 S-腺苷甲硫氨酸 S-腺苷同型半胱氨酸 血浆 -
束缚应激对大鼠S-腺苷甲硫氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸代谢的影响
目的：探讨束缚应激对肝脏S-腺苷甲硫氨酸（SAM）和S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）代谢的影响。方法Wistar大鼠16只随机均分为对照组和束缚应激组，束缚组每天束缚6 h，束缚6周。然后处死大鼠，用高效液相色谱法测定肝组织中SAM、SAH和S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAHH）的活性。以SAH单位时间生成量和减少量来计算该酶的合成活性和水解活性。结果束缚组大鼠肝脏SAM含量显著低于对照组（P＜0.05），而SAH含量却显著高于对照组（P＜0.05），束缚组SAM/SAH显著低于对照组（P＜0.05），两组SAHH合成活性间差异无统计学意义（P＞0.05），但束缚组SAHH水解活性显著低于对照组（P＜0.05）。结论慢性束缚应激可能抑制机体转甲基作用。
关键词： 束缚应激 S-腺苷甲硫氨酸 S-腺苷同型半胱氨酸 -
S-腺苷同型半胱氨酸单克隆抗体的制备及应用
目的通过制备S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)-BSA偶联物和SAH单克隆抗体(mAb),建立同型半胱氨酸(Hcy)免疫学测定方法.方法以二磺基琥珀酰辛二酸盐为连接剂制备SAH-BSA偶联物;PEG细胞融合技术制备SAH mAb,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定SAH mAb的特异性,以竞争ELISA测定Hcy.结果制备的SAH-BSA偶联物的克分子比为3～5,SAH mAb与Ado、半胱氨酸、蛋氨酸等无交叉反应;但与S-腺苷蛋氨酸为0.1～0.2 μmol/L时,存在交叉反应.初步建立的Hcy竞争ELISA测定区间为1～50 μmol/L,回收率为98%～101%,变异系数为1%～3%.与高效液相层析法有高度相关性(r= 0.983 6).结论我们制备的SAH-BSA偶联物和SAH mAb及建立的竞争ELISA法适用于Hcy测定.
关键词： S-腺苷同型半胱氨酸 抗体 单克隆 酶联免疫吸附测定 -
DNA甲基化在成人特发性血小板减少性紫癜发病机制中的作用
目的 从DNA甲基化角度探讨成人特发性血小板减少性紫癜(ITP)的发病机制.方法 应用SYBR Green实时定量PCR方法测定48例成人ITP患者与36例正常对照者外周血单个核细胞DNA甲基转移酶1(DNMTl)、DNA甲基转移酶3A(DNMT3A)和DNA甲基转移酶3B(DNMT3B)的mRNA的相对表达水平.采用反相高效液相技术(HPLC)检测ITP患者与正常对照血浆中S-腺苷蛋氨酸(SAM)和S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)含量.运用流式细胞术检测ITP患者与正常对照外周血CD_4~+和CD_8~+T细胞表面淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)亚单位C11a的表达水平.结果 成人ITP患者外周血单个核细胞DNMT3A和DNMT3B mRNA表达水平较对照组减低(P<0.01);DNMTl mRNA表达水平与对照组相比有降低趋势,但差异无统计学意义(P>0.05).成人ITP患者血浆SAH与对照组相比增高,差异有统计学意义(P<0.05);而血浆SAM和SAM/SAH比率与正常对照组相比差异无统计学意义(P值均>0.05).成人ITP患者外周血CD_8~+CD_(11a)~+细胞比例显著高于对照组(P<0.01),而CD_4~+CD_(11a)~+细胞比例和CD_4~+CD_(11a)~+/CD_4~+CD_(11a)~+比率较对照组显著降低(P值均<0.01),差异有统计学意义.结论 成人ITP患者外周血存在淋巴细胞低甲基化状态以及T细胞亚型上存在异常的CD_(11a)/LFA-1表达.DNA甲基化可能在ITP的发病中起一定的作用,但确切的作用机制还有待于进一步深入研究.
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人脐静脉内皮细胞内S-腺苷同型半胱氨酸升高与MCP-1表达的关系
目的 探讨胞内S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH)聚集损伤血管内皮细胞的分子基础,为阐明膳食高蛋氨酸摄入促进心血管疾病的病理机制提供实验依据.方法 以永生化的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为研究对象,经不同浓度的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)强效抑制剂3-deazaadenosine(DZA)处理24,48或72 h后,利用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定HUVEC内炎性分子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的含量,荧光定量-PCR法(qRT-PCR)检测MCP-1mRNA的相对表达量,甲基化特异PCR法(MSP)分析MCP-1基因启动子甲基化状态.结果 HUVEC经DZA处理后,与正常对照相比,胞内MCP-1的含量升高,mRNA的相对表达量上调,但其启动子甲基化方式并不发生改变.结论 内皮细胞SAH升高上调MCP-1的表达可能是膳食高蛋氨酸摄入促进心血管疾病的分子机制,但这种作用与MCP-1基因启动子的甲基化状态无关.
关键词： S-腺苷同型半胱氨酸 人脐静脉内皮细胞 单核细胞趋化蛋白-1 甲基化 -
S-腺苷同型半胱氨酸升高与人脐静脉内皮细胞损伤及整体基因组甲基化的关系分析
目的:探讨S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH)升高对血管内皮细胞的损伤效应与整体基因组甲基化的关系.方法:以永生化的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)为研究对象,用不同浓度的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosylhomocysteine hydrolase,SAHH)抑制剂3-deazaadenosine(DZA)处理24、48、72h,使用光学显微镜观察细胞形态学变化,电子显微镜观察细胞器超微结构变化,反相高效液相色谱法(reversed phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)测定胞内SAH浓度,荧光偏振免疫分析法(fluorescence polarization immunoassay,FPIA)测定Hcy的浓度,MTT法检测细胞生长增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,胞嘧啶延伸法检测整体基因组DNA甲基化水平.结果:HUVEC经DZA处理后,形态学上出现凋亡或坏死特征,培养基中同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)浓度下降,胞内SAH含量升高,细胞的生长增殖能力降低并出现凋亡现象,整体基因组的甲基化水平降低.结论:SAH升高能导致血管内皮细胞的损伤,且这种作用与整体基因组甲基化水平有关,SAH可能是动脉粥样硬化形成过程中的潜在生物标志分子.
关键词： S-腺苷同型半胱氨酸 动脉粥样硬化 人脐静脉内皮细胞 甲基化 -
冠心病患者Hcy和SAH与外周血淋巴细胞基因组甲基化相关性研究
目的:探讨冠心病患者血浆同型半胱氨酸(Hcy)和S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)与外周血淋巴细胞基因组甲基化水平的相关性.方法:选取山西省汾阳医院心血管内科冠心病患者70例(观察组),另选取70例健康人群为对照组,用酶联免疫吸附法检测血浆Hcy、SAH和DNA甲基转移酶(DNMTs)水平.提取全血淋巴细胞DNA,用酶联免疫吸附法检测淋巴细胞基因组甲基化水平.结果:与对照组比较,观察组血浆Hcy含量、SAH含量显著增高,差异有统计学意义(P＜0.05).与对照组比较,观察组血浆DNMTs含量、全基因组甲基化水平显著降低,差异有统计学意义(P＜0.05).观察组外周血淋巴细胞基因组甲基化与Hcy(r=-0.757,P＜0.05)、SAH(r=-0.94,P＜0.01)呈负相关,SAH与外周血淋巴细胞基因组甲基化相关性高于Hcy(Z =4.756,P＜0.01).DNMTs与Hcy(r=-0.537,P＜0.05)、SAH(r=-0.672,P＜0.01)呈负相关,SAH与DNMTs相关性高于Hcy(Z=7.745,P＜0.01).结论:冠心病患者外周血淋巴细胞基因组甲基化水平显著降低,与Hcy和SAH呈负相关,且与SAH的相关性高于Hcy.
关键词： 同型半胱氨酸 S-腺苷同型半胱氨酸 基因组甲基化 -
类风湿关节炎患者基因组DNA甲基化水平的初步研究
目的 研究类风湿关节炎(RA)患者基因组DNA甲基化水平及影响基因组DNA甲基化水平的因素;并分析其与CD4+T细胞表面LFA-1表达水平的联系,探讨基因组DNA甲基化水平变化与RA发病的关系.方法 测定21例RA患者和20名正常对照的血浆Hcy、s-腺苷蛋氨酸(SAM)和s-腺苷同型半胱氨酸(SAH)的水平,CD4+T细胞表面LFA-1的表达水平,以及亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因677位的多态性.结果 ①RA组与对照组相比,SAM明显降低,SAH明显升高,其差异有统计学意义;提示RA患者基因组DNA甲基化水平明显降低;②SAM与Hcy呈负相关,SAH与Hcy呈负相关,相关系数分别为-0.932、0.924,P＜0.01;③RA组CD4+T细胞表面LFA-1表达较对照组增高,与Hcy呈正相关(r=0.557,P＜0.01),与SAM呈负相关(r=-0.651,P＜0.01);④MTHFR基因677位C→T的突变不仅导致Hcy水平升高,同时使基因组DNA甲基化水平降低,使CD4+T细胞表面LFA-1表达增多.结论 ①RA患者普遍有基因组DNA甲基化水平降低;②基因组DNA低甲基化可能与MTHFR基因的突变和高Hcy血症有关;③基因组DNA低甲基化可能通过影响RA患者的某些基因的表达异常参与疾病的发生发展.
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S-腺苷同型半胱氨酸与动脉粥样硬化
同型半胱氨酸(Hcy)一直被视为心血管疾病的一个独立危险因素,但近年来的研究发现高Hcy很可能不是引起血管损伤的真正致病因素,而只是一个伴随现象.Hcy的前体物质S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)可由Hcy逆向合成,SAH升高能诱导血管内皮细胞的损伤,参与动脉粥样硬化的形成,其机制与抑制DNA甲基化有关.SAH可能是较Hcy更敏感的预测心血管疾病风险的指标.
关键词： S-腺苷同型半胱氨酸 动脉粥样硬化 危险因素 -
Sirt1对糖尿病心肌病大鼠早期心肌S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的调节作用及其机制研究
目的:通过建立糖尿病大鼠模型,探讨沉默信息调节因子(Sirt1)对S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)糖尿病心肌病早期的调节作用及其机制. 方法:采用高脂饮食联合链脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型,分为对照组、早期糖尿病模型组(DM组)和白藜芦醇处理组(RES组),RES组给予白藜芦醇2.5 mg/(kg·d)灌胃2周处理.HE染色法观察心肌组织病理结构变化,超声心动图检测心功能相关指标,高效液相色谱法检测同型半胱氨酸(Hcy)、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)及S-腺苷同型半胱氨酸(SAH),Western blot检测各组心肌组织SAHH、Srit1等蛋白表达变化. 结果:显微镜下DM组大鼠心肌组织可见不同程度炎细胞浸润、甚至变性,而RES组心肌组织可见少量炎性细胞浸润,少量心肌细胞呈长杆状,坏死灶不明显,嗜酸性变较DM组轻.HPLC检测结果显示对照组、DM组和RES组的Hcy分别为(45.37±7.99)、(101.78±16.77)和(86.33±10.09) μmol/L,DM组和RES组较对照组升高,但RES组低于DM组;SAH分别为(50.33±7.34)、(22.92±4.32)和(33.45±7.88) μmol/L,DM组和RES组较对照组降低,但RES组高于DM组;SAM分别为(66.34±9.99)、(69.56±9.01)和(70.89±11.33) μmol/L,各组间无显著差异;SAHH分别为(44.11±5.17)、(92.33±17.56)和(19.73±4.07) μmol/L,DM组较对照组升高,RES组较对照组降低;Srit1分别为(80.12±10.09)、(29.11±3.91)和(107.32±13.24) μmol/L,DM组较对照组降低,RES组较对照组升高. 结论:SAHH及下游Hcy等的表达可能是早期糖尿病心肌病发生发展的重要作用机制,而Sirt1对SAHH的表达调控作用可能起重要作用.
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HPLC法测定人红细胞中的S-腺苷同型半胱氨酸和S-腺苷甲硫氨酸
目的 建立HPLC法测定人红细胞中S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)浓度的方法.方法 人红细胞经同体积醋酸盐缓冲液稀释后,经10％高氯酸蛋白沉淀后直接进样.采用Athena C18 WP柱(150 mm×4.6 mm,3 μm),柱温35℃,流动相为含5 mmol·L-1庚烷磺酸钠的50 mmol·L-1 NaH2PO4缓冲液(pH 4.0)-甲醇(80∶20,v/v),流速:1.0mL·min-1,检测波长254 nm.采用外标法定量.结果 SAH和SAM分别在0.025～10 mg·L-1和0.05～20 mg·L-1内线性关系良好,SAH和SAM的日内、日间RSD均＜12％,加样回收率在95.5％～106.3％,样品提取后在24 h内稳定性良好.结论 该法快速、简便、准确,适用于SAH和SAM的体内分析检测.
关键词： 高效液相色谱法 S-腺苷同型半胱氨酸 S-腺苷甲硫氨酸 人红细胞 -
蛋氨酸代谢与动脉粥样硬化
蛋氨酸是哺乳动物正常生长和发育的必需氨基酸,但蛋氨酸摄入过高促进动脉粥样硬化的发生,其具体机制尚不明确,至今提出了几种学说,如血浆同型半胱氨酸升高学说和DNA甲基化学说.然而,随着研究的进展及对蛋氨酸代谢研究的深化,S-腺苷同型半胱氨酸在高蛋氨酸促进动脉粥样硬化的发生中似乎显得更为关键.
关键词： 蛋氨酸代谢 动脉粥样硬化 同型半胱氨酸 S-腺苷同型半胱氨酸 DNA甲基化 -
慢性肾脏病患者血浆S-腺苷同型半胱氨酸水平与基因组DNA甲基化的关系
目的 研究慢性肾脏病(CKD)患者血浆S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水平与整体基因组DNA甲基化的关系.方法 选择CKD患者43例和健康对照组36例,ELISA法检测血清Hey浓度,酶连续循环比色法检测血清SAH浓度,高效液相色谱检测基因组DNA甲基化程度.结果 CKD患者血浆SAH较健康对照组明显升高,而基因组DNA甲基化水平降低.血浆SAH浓度与基因组DNA甲基化呈明显负相关.结论 CKD患者血浆SAH水平升高可导致异常的基因组DNA甲基化,可能参与CKD患者心血管并发症的发生发展.
关键词： 慢性肾脏病 S-腺苷同型半胱氨酸 DNA甲基化 -
基因组甲基化与慢性荨麻疹发病机制间的关系的初探索
目的 通过检测慢性特发性荨麻疹和自身免疫性荨麻疹的基因组甲基化水平,初步探讨基因组甲基化与其发病机制间的关系.方法 采用ASST方法将45例慢性荨麻疹患者分为慢性特发性荨麻疹组和自身免疫性荨麻疹组.分离血清,分别检测血清中TgAb、TPOAb、ANA、SAM和SAH水平,并对结果进行统计分析.结果 慢性荨麻疹患者ASST阳性率46.7％,对照组ASST全部阴性,两组比较差异有统计学意义(P＜0.01).自身免疫荨麻疹组自身抗体检出率高,TGAb、TPOAb和ANA的阳性率分别是23.80％、14.29％、14.29％;与慢性特发性荨麻疹组及对照组比较,自身免疫荨麻疹组TGAb差异均有统计学意义(P＜0.05),TPOAb和ANA的差异均无统计学意义(P＞0.05)；慢性特发性荨麻疹组与对照组比较,三种自身抗体差异均无统计学意义(P＞0.05).自身免疫性荨麻疹组SAM较其它两组低,而SAH高于其它两组,SAM/SAH也较其它两组小,但差异均无统计学意义(P＞0.05).慢性特发性荨麻疹组SAM、SAH和SAM/SAH与对照组比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 我科门诊慢性荨麻疹患者中,自身免疫性荨麻疹所占比例达46.7％；TGAb在自身免疫性荨麻疹患者中阳性率显著高于慢性特发性荨麻疹,能否作为一种有价值的自身免疫性荨麻疹的临床检测指标有待进一步研究；SAM、SAH及其比值在自身免疫性荨麻疹、慢性特发性荨麻疹及对照组中无统计学差异,似乎甲基化并不参与到自身免疫性荨麻疹的发病机制中,但有待更大的样本量证实.
关键词： 荨麻疹 DNA甲基化 S-腺苷蛋氨酸 S-腺苷同型半胱氨酸 -
慢性肾脏病患者血清S-腺苷同型半胱氨酸与心血管并发症的关系
目的 研究同型半胱氨酸(Hcy)的前体物质--腺苷同型半胱氨酸(SAH)水平与慢性肾脏病(CKD)患者心血管并发症的关系.方法 选择CKD患者55例和对照组32例,检测并记录患者心血管并发症,酶连续循环比色法检测血清SAH浓度,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血清Hcy浓度,同时采用全自动免疫分析仪检测血清叶酸、维生素B12浓度.结果 CKD患者血清Hcy及SAH均较对照组明显升高,且SAH升高程度更明显.有心血管并发症者血清SAH水平明显高于无并发症组.多因素逐步logistic回归分析显示,高SAH血症是CKD患者心血管并发症的危险因素.两组血清叶酸和维生素B12水平无明显差异.结论 CKD患者血清SAH水平较Hcy更敏感预测心血管并发症,血清SAH与Hcy水平均与患者的肌酐水平明显相关.
关键词： 心血管疾病 慢性肾脏病 S-腺苷同型半胱氨酸 -
胞内S-腺苷同型半胱氨酸升高抑制HUVEC增殖和 ER-α表达的关系
目的 探讨S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH)升高抑制血管内皮细胞增殖和雌激素受体-α(estrogen receptor-α,ER-α)基因表达变化的关系.方法 以分离的原代人脐静脉内皮细胞(hu-man umbilical vein endothelial cell,HUVEC)为研究对象,经不同浓度的SAH水解酶强效抑制剂3-deazaadenosine (DZA)处理24～72h后,反相高效液相色谱法测定胞内SAH浓度,利用细胞计数法、流式细胞仪和了TUNEL技术检测细胞的增殖凋亡能力,Western blot法检测Eft-α蛋白的表达,荧光定量-PCR检测其mRNA表达,甲基化特异PCR法检测Eft-α基因启动子甲基化状态.结果 经DZA处理后,HUVEC胞内SAH浓度升高(P<0.05),生长增殖能力降低(主要受阻于G1/G0期),凋亡率增加(P<0.05),ER-αmRNA和蛋白的相对表达量降低(P<0.05),但DZA处理前后ER-α基因启动子甲基化状态不发生明显改变.结论 SAH升高抑制HUVEC的增殖能力与ER-α的表达变化有关,但这种作用不是通过改变ER-α基因启动子的甲基化而实现的.
关键词： S-腺苷同型半胱氨酸 人脐静脉内皮细胞 雌激素受体-α 甲基化
