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雄激素对表皮生长因子受体表达和激活的影响
目的:检测表皮生长因子受体(EGFR)在雄激素依赖和非雄激素依赖的细胞株中的表达和激活并探讨雄激素对其影响. 方法:先用双氢睾酮(DHT)以不同时间处理雄激素依赖前列腺癌(PCa)细胞株LNCaP及非雄激素依赖人PCa细胞株DU-145、PC-3,然后采用Western 印迹方法检测EGFR的表达,采用免疫沉淀和Western 印迹法检测EGFR磷酸化水平,以测定雄激素对LNCaP的EGFR表达和激活的影响.结果:DHT可使LNCaP中EGFR的表达明显增强,在使用5 nmol/L DHT孵育24 h后明显,并显示EGFR的表达增加和被激活是同步的.在DU-145和PC-3中未见类似现象出现.结论:雄激素依赖的LNCaP的EGFR表达增加和被激活,这种作用是通过雄激素/雄激素受体信号转导途径.雄激素刺激PCa细胞增生的机制涉及EGF/EGFR的信号转导途径.
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褪黑素受体亚型蛋白的免疫组化检测方法
1 方法介绍1.1 组织标本制备新鲜待检组织立即用4%多聚甲醇固定,常规脱水、透明、浸蜡,石蜡包埋组织,4℃冰箱贮存待检测.1.2 主要步骤将石蜡包埋组织作4 μm的连续切片,在37℃烘箱过夜.石蜡切片用二甲苯脱腊10 min×3,梯度乙醇洗2 min×3,3%过氧化氢溶液处理10 min,以阻断内源性过氧化物酶活性.蒸馏水洗2 min×3,0.01 mol/L,pH 6.0柠檬酸缓冲液微波修复抗原10 min,冷却后蒸馏水洗2 min×3,PBS洗2 min×3.每张切片加50 ml非免疫性动物血清温室孵育10 min,每张切片加50 ml 鼠抗人mt1和MT2受体亚型单克隆抗体(1∶75)置湿盒内4℃过夜,PBS洗2 min×3,每张切片加50 μl生物素标记的第二抗体温室孵育20 min,PBS洗2 min×3,切片加50 μl链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶溶液,温室孵育20 min ,PBS洗2 min×3,每张切片加新配制的液体二氨基联苯胺(DAB)显色5~10 min,流水冲洗,苏木精复染,中性树胶封片,以PBS代替第一抗体作为空白对照.
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离体肺组织切片的制备和孵育
目的建立一种简便有效的离体肺组织切片孵育方法.方法利用肺组织精细切片技术制备肺组织切片,以0.5 mL Krebs-Henseleit(K-H)缓冲液作为孵育液,在37 ℃培养箱内分别孵育1、2、3、4 h,测定肺片的四甲基偶氮唑盐(MTT)比色、乳酸脱氢酶(LDH)释放率和三磷酸腺苷(ATP)含量,以反映肺组织活性.结果肺片在37 ℃培养箱内孵育1、2、3、4 h后MTT比色、LDH释放率和ATP含量均无统计学差异(P>0.05).结论应用0.5 mL Krebs-Henseleit(K-H)缓冲液作为孵育液、在37 ℃培养箱对肺片进行孵育时组织活性没有明显变化,可作为一种简便有效的孵育方法用于离体肺片研究.
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糠秕马拉色菌对角质形成细胞增殖的作用
有人用糠秕马拉色菌和角质形成细胞共同培养的方法研究糠秕马拉色菌对角质形成细胞生物学行为的影响[1].我们采用不同浓度比值的糠秕马拉色菌和角质形成细胞共同孵育的方法,观察不同浓度糠秕马拉色菌作用下角质形成细胞的增殖情况,并对其可能的机制展开研究.
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面包干酵母致热病理模型的改良研究
目的 改良干酵母悬液致热病理模型,消除动物 皮下注 射后存在的体温下降期。方法 将酵母悬液在34℃恒温水浴中 孵育0. 5 h,与对照组(未孵育酵母悬液)比较大鼠皮下注射后1、2、3、4、6、8 h的肛温。结果 孵育组体温无下降期,升温快。两组大鼠各测点经t检验, 均有显 著性差异P<0.05或P<0.01。结论 34℃体外孵育干 酵母悬液0.5 h后致热病理模型,大鼠体温无下降期。
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ELISA振动式孵育用于脂浊血清样本HBsAg检测
脂浊血清样本由于血清粘度加大及乳糜微粒的屏蔽效应,使ELISA检测时抗原抗体的结合几率下降,从而造成对样本检测的负干扰,对低浓度样本可致阴阳性改变.振动式孵育有利于抗原抗体的结合,提高试剂检测灵敏度及阳性检出率,抑制钩状效应等特性[1,2],但其用于脂浊血清样本检测尚未见有报道.本文对此进行了探讨.
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己酮可可碱对睾丸精子活动力及存活率的影响
由于睾丸精子活动力极弱,很难通过活动力直接判断其存活情况.己酮可可碱可以提高射出精子的活动能力的研究已有报道,而对睾丸精子的相关研究甚少.本文通过对37例穿刺获得的睾丸精子体外与己酮可可碱孵育后精子存活率、运动力变化的观察.
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HPLC测定人肝转基因细胞中的盐酸维拉帕米
目的:为了研究盐酸维拉帕米经人肝CYP450转基因细胞的代谢, 建立了反相高效液相色谱的测定方法.方法:与人肝转基因细胞提取的S 9上清液孵育之后的样品用二氯甲烷-异丙醇(9∶1,V/V)提取,采用地西泮作为内标,以S him-pack CLC-ODS C18为色谱柱,甲醇-水-三乙胺(60∶40∶0.4,V/V),pH 6 .4为流动相,紫外检测波长为235nm,流速0.5 ml*min-1.结果:维拉帕米浓度在5~320 μg*ml-1范围内线性关系良好,r=0.9999,n=6.检测限为6.25 ng(S/N≥3),定量限为9.4 ng±1.06 ng,相对标准偏差(RSD)<12%(n=5) .方法回收率达94.4~9 9.6%,日内、日间RS D分别为5.9~2.9%,5.2~3.8 %(n=5).结论:此方法简便、准确,可用于研究盐酸维拉帕米在人肝转基因细胞中的代谢.
关键词: 维拉帕米 反相高效液相色谱 细胞色素P450转基因细胞 孵育 -
高效液相色谱法测定人肝细胞色素P450 3A4转基因细胞中氨氯地平
目的:研究氨氯地平经人肝细胞色素P450 3A4(CYP3A4)的代谢,建立反相高效液相色谱的测定人肝转基因细胞CYP3A4酶S9孵育液中氨氯地平浓度的方法.方法:与人肝转基因细胞提取的S9上清液孵育之后的样品,用3倍量的甲醇沉淀后离心,取上清液用0.45 μm微孔滤膜滤过后进样.采用Hypersil C18柱,以乙腈-磷酸盐缓冲液(45∶55,v/v,pH 4.5)为流动相,普萘洛尔为内标,在250 nm波长处测定.结果:氨氯地平浓度在0.2~30.0 μg/ml范围内线性关系良好,r=0.9993,方法平均回收率为(98.2±2.4)%(n=5),日内和日间相对标准偏差(RSD)均小于10%,检测限为20 ng/ml,定量限为0.2 μg/ml(回收率为104.0%,RSD为11.4%,n=5).结论:建立的反相高效液相色谱方法简便、准确,可用于研究氨氯地平在人肝CYP3A4转基因细胞中的代谢.
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不同孵育温度对免疫组化染色结果的影响
手工操作目前仍是大部分基层病理科免疫组化操作的主要方法,由于实验条件难以标准化从而影响免疫组化切片染色质量,常给诊断带来困难,甚至会引起严重的不良后果.本文现介绍一种恒温水浴法,可获得满意的染色效果.
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内毒素对气管上皮细胞损伤的实验研究
目的 脱察不同浓度内毒素(LPS)作用不同时程对气管上皮细胞(HBE)的损伤作用.方法 取处于对数生长期的HBE,加入LPS的终浓度分别为0.02 μg/ml、0.04 μg/ml、0.06 μg/ml、0.08 μg/ml、0.1 μg/ml、0.2 μg/ml、0.4 μg/ml、0.6 μg/ml、0.8 μg/ml、1.0 μg/ml,在培养箱内分别孵育24 h、48 h后,采用MTT比色法于酶联免疫测定仪490 nm波长处测定OD值.结果 作用24 h后,各浓度LPS对HBE具有不同程度的损伤作用,其中以0.1 μg/ml作用为明显(0.4080±0.0217 vs 0.3800±0.0100,P<0.01);作用48 h后,符浓度LPS对HBE具有不同程度的损伤作用,其中以0.1 μg/ml作用为明显(0.3900±0.0122 vs 0.3060±0.0230,P<0.01).结论 根据LPS致气管上皮细胞损伤的量效及时效关系,选择0.1 μg/ml作用24 h作为细胞刺激条件较为适宜.
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毛冬青甲素对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及迁移的影响
目的 观察毛冬青甲素(ilexonin A,IA)对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖的影响,并探讨IA是否通过上调CXCR4的表达促进大鼠BMSCs迁移.方法 采用MTT比色法检测IA(3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400、800 mg ·L-1) 预处理BMSCs 24、48、72 h,观察对BMSCs增殖的影响,确定佳药物浓度和佳作用时间.用佳浓度的IA干预第3代 BMSCs 48 h,Transwell 检测 BMSCs 迁移能力, Western blot法检测CXCR4的表达水平.结果 MTT结果显示,IA孵育BMSCs 24、48 h,与对照组相比,100 ~800 mg ·L-1组的细胞增殖明显减少(P<0.05);IA孵育BMSCs 48 h,与对照组相比,6.25、3.125 mg·L-1组细胞增殖明显增加(P<0.05);IA孵育BMSCs 72 h,与对照组相比,12.5~800 mg·L-1组细胞增殖明显减少(P <0.05),提示 IA 6.25、3.125 mg·L-1剂量组于48 h预处理BMSCs是优选择.Transwell细胞迁移实验表明,IA (6.25、3.125 mg·L-1)预处理BMSCs 48 h 明显增强 BMSCs 运动迁移能力 (P <0.05),且迁移与 IA浓度无关,CXCR4拮抗剂 AMD3100可完全阻断其促迁移效应.Western blot 显示,IA (6.25、3.125 mg·L-1)预处理BMSCs 48 h,上调CXCR4蛋白表达(P<0.05).结论 IA可以促进BMSCs的增殖,并通过上调CXCR4的表达,提高BMSCs的迁移能力.
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贝氏柯克斯体在鸡胚中生长繁殖的研究
研究贝氏柯克斯体在鸡胚中的生长繁殖特征,以便获得大量的贝氏柯克斯体全细胞抗原.将5个贝氏柯克斯体感染鸡胚卵黄膜用5ml无菌肉汤研磨,取一定量的菌液倍比稀释成四个浓度,分别接种四组7日令鸡胚(每组12个),0.3ml/枚,35℃孵育培养,找出佳接种剂量进行大量鸡胚接种,繁殖贝氏柯克斯体.①1:160浓度接种后,大多数鸡胚集中在第8天死亡外,其它各组大部分鸡胚死亡在接种后的3-5天;鸡胚卵黄膜涂片染色后显微镜下检查,发现第7、8天死亡的鸡胚中贝氏柯克斯体的量明显高于接种后3~5天中死亡的鸡胚.②选择1:160菌液浓度,0.3ml/枚的量,分别接种90枚、194枚、142枚、149枚鸡胚,绝大部分鸡胚在接种后7~10天内死亡,用它们的卵黄囊膜涂片,染色镜检均发现大量的贝氏柯克斯体.从感染贝氏柯克斯体后第8天左右死亡的鸡胚中可获得佳的贝氏柯克斯体繁殖量.
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消除免疫组化非特异性染色方法研究(附60例分析)
免疫组化标记结果的判断是以观察组织片阳性或阴性染色为前提,观察阳性染色颗粒定位有助于区别特异性和非特异性背景的染色,如何消除和克服影响抗原定位的各种因素,是确保结果准确性的重要环节.在免疫组化染色中,我们注意了以下几点:染色过程中防止切片干燥;操作过程中PBS液(pH7.2)冲洗充分;用新配制的3%H2O2封闭10分钟;用免疫动物血清封闭10分钟;一抗孵育60分钟;二抗、三抗各孵育10分钟;DAB显影3~10分钟,镜下观察,仍然有时会出现非特异性染色.如何解决这一问题,在正常肾脏组织中含有多量内源性生物素,文献报道可用蛋清封闭能达到较好的染色效果.我们选取本院2002~2003年肾肿瘤组织60例分蛋清组和非蛋清组进行P170、GSTπ对照实验.
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操作因素对ELISA检测结果的影响
酶联免疫吸附试验(ELISA)是目前临床中应用为普遍的一种血清学检测方法,但影响ELISA检测质量的因素很多,如试剂因素、标本因素和操作因素等.试剂的质量固然是影响检测结果准确性的关键因素,然而检测人员的操作是否规范合理对ELISA检测结果的影响也不可忽视.该文选用3个厂家的ELISA HBsAg检测试剂分别就洗涤次数、孵育条件、显色剂加入方式及试剂混用等操作因素对检测结果产生的影响进行了分析比较,现报告如下.
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045 当归对人红细胞脆性的影响
目的: 体外观察不同浓度的当归孵育对人红细胞脆性的影响. 方法: 采用脆性测量仪, 检测红细胞在有或无当归情况下随着悬浮介质渗透压不断降低, 细胞形态由膨胀至终破裂、溶血过程中, 红细胞开始溶血、 50%红细胞溶血以及全部红细胞发生溶血出现的时间(Ti, T50, Tt)及溶液介质中NaCl浓度(Hi, H50, Ht). 结果: (1) 当归(5 mg/ml)组与对照组相比, Hi, H50, Ht均显著延长, Ti, T50显著降低. Tt变化无显著性. (2) 当归(20 mg/ml)组与对照组相比, Hi, H50显著延长, Ht, T50, Tt变化无显著性. 结论: 当归能使红细胞在更低的渗透压水平发生溶血的时间延缓. 提示当归特别是在5 mg/ml的浓度时具有保护红细胞的效应.
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二甲双胍对乳腺癌细胞株的抑制作用
本实验旨在观察二甲双胍对乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231的影响,探讨其抗肿瘤的作用及其机制.一、材料和方法1.人乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231复苏,扩增.收集对数生长期的细胞,调整细胞浓度为5×105个/ml.共设4组:空白对照组、二甲双胍组、表阿霉素组、二甲双胍+表阿霉素组.每组设3孔,每孔(6孔板)加入细胞总数为5×105个,加入相应的药物及培养液.孵育48 h,计数.流式细胞仪检测.
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诱导型一氧化氮合成酶在OxyHb诱导的血管痉挛细胞模型中的表达
我们应用氧合血红蛋白(OxyHb)孵育平滑肌细胞,构建脑血管痉挛细胞模型,通过免疫细胞化学和比色法检测细胞诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)表达及上清液一氧化氮(NO)含量,探讨其在脑血管痉挛过程中的作用.
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脱除猪主动脉瓣细胞的研究
组织工程心脏瓣膜是利用组织工程学技术,将受体活性细胞种植在生物可降解材料支架上,孵育出活性心脏瓣膜,无免疫原性,不需抗凝,耐久性强,有自身修复能力.本研究旨在探讨脱除猪主动脉瓣上细胞成分的方法,评价其效果,为组织工程心脏瓣膜的构建提供较理想的生物材料.
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腹腔镜中不同膨腹气体抑制肿瘤细胞生长的体外对比研究
本实验旨在研究CO2、He、N2O等不同膨腹气体在模拟气腹条件下,对肿瘤组织体外生长的影响,结果报道如下。 一、材料与方法 肿瘤细胞为人类肝癌细胞株SMMC7721(购于中国科学院细胞研究所),体外培养于RPMI 164 0完全培养液(含体积分数为10%小牛血清及10万U/L青链霉素)中。传2~3代(至少1周以上)后,以台盼蓝染色后在荧光显微镜下记数,制成5×102个/L的单细胞悬液。悬液分别注入4个( 4组)无菌医用引流袋(带防漏阀)中,用自动气腹仪(Laproflator electronic 3509,WE STGmbH,Germany)自引流袋入口管分别注入CO2、He及N2O,对照组不附加任何气体。 3个实验组气体压力达15 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa),于37 ℃孵育箱中维持模拟气腹状态45 min,对照组为大气压力,37 ℃孵育箱中孵育45 min。取出后的细胞悬液用台酚蓝染色后在荧光显微镜下记数4个组存活细胞的比值,同时4个组细胞悬液分别加入96 孔板内。每孔细胞数为5×104个,每组做12复孔,于模拟气腹后24、48、72 h分别用四唑蓝(MTT,美国Sigma公司,微量酶反应于分光光度计在波长为570 nm测定比色值以检测细胞抑制率。 统计学方法:各组间比色值用Student t检验。 二、结果 “气腹’后4个组细胞存活百分比差异无显著性(P>0.05),其中CO2组为(92.3±1.2)%,He组为(89.6±2.5)%, N2O组为(90.5±±3.1)%,对照组为(90.7±3. 1)%。在观察的72 h中,肿瘤细胞均生长。气腹后测定各组pH值结果: CO2组为6.6, He组为9.8, N2O为8.2, 对照组为7.3。以MTT法对细胞进行抑制率测定(图1), CO 2组在“气腹”后第24小时与He组、N2O组和对照组相比, MTT值(对照孔-用药孔 /对照孔×100)上升,差异有非常显著性(P<0.01); He组较 N2O组和空白组明显下降(P<0.05), N2O和对照组之间MTT值差异无显著性(P>0.05)。第48小时CO2组与其他3个组相比,MTT值亦上升,其中较 H e组差异有非常显著性(P<0.01),较N2O和对照组差异有显著性(P<0.05),He组较N2O和对照组下降,差异有显著性(P<0.05),N2O和对照组之间差异无显著性(P>0.05)。第72小时,各组MTT值差异均无显著性(P>0.05)。