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新生鼠肺成纤维细胞原代培养方法的比较与体外肌成纤维细胞分化模型的建立
目的 肌成纤维细胞(fibroblasts,FB)是器官纤维化形成过程中关键的靶细胞,以特异表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和细胞基质沉积为特征.文中比较胰蛋白酶消化法和组织贴壁法原代培养乳鼠肺FB的优缺点,并报道体外肌FB分化模型的建立.方法 分别采用胰蛋白酶消化法和组织贴壁法原代培养乳鼠肺FB,倒置相差显微镜观察原代培养,MTT法检测细胞增殖,免疫细胞化学染色法鉴定细胞来源,采用转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导FB向肌FB分化.结果 采用胰蛋白酶消化法和组织块贴壁法均可以成功原代培养鼠胚肺FB,2种方法无论在形态、细胞增殖水平还是在细胞鉴定方面均无差异,但胰蛋白酶消化法在相同条件下能够快速获得较组织贴壁法更多的细胞,且2种方法获得的FB在4代之内均不表达α-SMA,需经TGF-β1诱导分化为肌FB.随TGF-β1诱导时间的延长,α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白表达上调.结论胰酶消化法较组织贴壁法能快速、大量获得纯度较高的FB,4代以内的乳鼠FB适合建立肌FB分化模型.
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Smads信号通路在转化生长因子-β1诱导气道上皮细胞转分化中的作用
目的:探讨Smads信号通路在rhTGF-β1体外诱导气道上皮细胞表型向肌成纤维细胞转分化中的作用.方法:用TGF-β1(10 μg/L)处理气道上皮细胞株16HBE,Western blot法检测刺激不同时间点细胞核蛋白内磷酸化Smad 2和Smad 3(30min、24h和48 h)的表达;脂质体法瞬时转染Smad 7表达载体pCDNA 3.0/Smad 7或空载体,转染20h后,加入TGF-β1处理,RT-PCR法检测刺激不同时间E-钙黏蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的基因表达,免疫荧光法检测α-SMA的蛋白表达. 结果:①正常对照组核内无磷酸化-Smad 2表达,Smad 3有微弱表达,TGF-β1刺激30min时表达量明显增加,随着刺激时间的延长,表达量进一步增加;②TGF-β1刺激24h,瞬时转染Smad 7组α-SMA表达量低于相应转染空载体组,E-钙黏蛋白表达量明显高于相应转染空载体组,TGF-β1刺激36h后Smad 7组α-SMA、E-钙黏蛋白表达量与相应空载体组相似;免疫荧光显示转染Smad 7组α-SMA阳性细胞数显著低于空载体组(P<0.05). 结论:Smads信号通路参与了TGF-β1诱导的支气管上皮细胞株16HBE向肌成纤维细胞转分化过程.
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γ-干扰素对兔胆总管愈合过程中细胞增殖和转化的影响
目的观察γ-干扰素(IFN-γ)对兔胆总管损伤愈合过程中核增殖抗原(PCNA)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响,为临床防治胆管狭窄寻求一条新的途径.方法制作免胆总管损伤修复模型16只,随机分为实验组和对照组各8只,实验组每天肌注IFN-γ 10万IU/kg,对照组肌注等体积生理盐水,8周后处死动物,取材,行HE染色,PCNA和α-SMA免疫组化染色,图像分析仪定量分析.结果实验组细胞增殖指数和α-SMA平均阳性染色面积百分比与对照组相比差异均有显著性意义.结论γ-干扰素通过抑制胆管壁PCNA和α-SMA的表达,抑制胆管壁细胞增殖和转化.
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癌相关成纤维细胞与肿瘤细胞相互作用对肿瘤发生发展的影响
间质细胞与细胞外基质成分构成的肿瘤微环境对肿瘤细胞的生长、浸润和转移具有重要作用.特征性间质改变通常伴随甚至先于上皮细胞的恶变.这一过程中的关键成分--活化的成纤维细胞,又称为肌成纤维细胞或者癌相关成纤维细胞,是肿瘤间质中数量丰富的细胞类型,它们通过细胞与细胞间相互接触,在各种可溶性因子的媒介作用下,促进上皮细胞恶性转化.文中主要介绍癌相关成纤维细胞及其在肿瘤发生发展中的作用.
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a-SMA与Vimentin在慢性硬膜下血肿外膜中的表达及意义
目的 采用a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)与波形蛋白 (VIM)鉴定和分类慢性硬膜下血肿(CSDH)外膜中的肌成纤维细胞 (MFB),并探讨两者表达的意义.方法 选取CSDH 9例患者的硬脑膜和其下的血肿膜,采用免疫组化法检测a-SMA和VIM在CSDH外膜中的表达,采用透射电镜观察细胞形态结构.结果 CSDH血肿膜中细胞数量较多,可见许多新生毛细血管;共同表达a-SMA和VIM的细胞有两种,其中一类细胞呈梭形(为肌成纤维细胞),另一类是血管管壁的细胞(为血管内皮细胞);阳性表达的棕黄色颗粒状均位于胞质内.电镜观察可见MFB细胞特征性形态,胞核有很多切迹,沿细胞长轴的边缘有束状肌动蛋白细丝排列.结论 a-SMA与VIM的广泛表达和持续分布可能在CSDH的发生发展中有重要作用.
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α平滑肌肌动蛋白在慢性肾小球肾炎患者小管间质中的表达
目的 探讨α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在不同病理类型的原发性慢性肾小球肾炎患者肾小管间质中的表达特征。方法 采用免疫组织化学SAP法检测69例慢性肾小球肾炎患者肾穿刺标本中α-SMA的表达，并对小管间质病变进行分级。结果 对照组肾组织中α-SMA仅在血管平滑肌细胞上有表达，患者组肾小管间质α-SMA表达均呈阳性；慢性肾小球肾炎患者小管间质α-SMA表达阳性率随小管间质损害程度增高而增加(P＜0.01)；小管间质α-SMA表达阳性率与患者血肌酐、尿素氮水平呈正相关(n=69，r=0.514、0.582，均P＜0.001)。结论 肾间质的肌成纤维细胞参与慢性肾小球疾病的肾间质纤维化过程。
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肌成纤维细胞在CSDH外膜中分布的初步研究
目的:探讨肌成纤维细胞(MF)在慢性硬膜下血肿(CSDH)外膜中的分布状况.方法:选择CSDH9例,取硬脑膜和其下的血肿膜,采用免疫组化法检测MF的特征性标记平滑肌肌动蛋白α(α-SMA)在CSDH外膜中的表达,HE染色光镜和透射电镜观察MF的形态结构.结果:CSDH血肿外膜中许多梭形细胞表达α-SMA,阳性的棕黄色颗粒位于胞浆内.HE染色可见,血肿外膜与硬膜间有明显分界,CSDH外膜中细胞数量较多,可见许多新生毛细血管.电镜观察,可见MF细胞特征性形态,胞核有很多切迹,有束状肌动蛋白细丝排列.结论:MF在CSDH外膜中广泛持续分布,提示其与CSDH的发生发展有关系.
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细胞凋亡与肺纤维化关系研究新进展
细胞凋亡是细胞的程序化死亡,与细胞增殖是一对矛盾,正常两者处于平衡状态.肺纤维化(PF)是各种原因导致的增殖性疾病,是不同肺间质疾病的共同结局,其特征是间叶细胞(成纤维细胞、肌成纤维细胞、平滑肌细胞)过渡增殖,细胞外基质的过度积聚,而正常肺组织结构被破坏.
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基质细胞衍生因子-1及 Wnt 信号对肌成纤维细胞生物特性的影响
目的：探讨基质细胞衍生因子-1（SDF-1）及 Wnt 信号通路对诱导生成的肌成纤维细胞的生物学特性的影响。方法首先体外诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化为肌成纤维细胞（MF），然后改变SDF-1及（或）Wnt 信号，通过划痕实验观察 MF 迁移能力的变化，qRT-PCr 检测Ⅰ型胶原（ColⅠ）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达的改变。结果转化生长因子（TGF-β）及高浓度血清等条件的诱导，可使 BMSCs 分化为 MF。阻断 SDF-1或 Wnt 信号时，会显著抑制 MF 的迁移及 Col-Ⅰ的分泌，阻断 Wnt 信号可明显抑制 BMSCs向 MF 的分化。结论SDF-1与 Wnt 信号参与调节 MF 的迁移及 ColⅠ分泌，Wnt 信号对 BMSCs 向 MF 分化具有重要作用。
关键词： 肌成纤维细胞 趋化因子CXCL12 Wnt信号通路 胶原Ⅰ型 -
特发性肺间质纤维化发病机制新进展
特发性肺间质纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis IPF)是弥漫性间质性肺病中的一种特殊类型,是一种原因不明、出现在成人、局限于肺、进行性致纤维化的间质性肺炎,其临床诊断主要依靠病理,美国ATS新指南指出将HRCT列为独立诊断标准之一,其组织病理学和放射学表现为普通型间质性肺炎(usual interstitial pneumonia,UIP).UIP显著的组织病理学特点是伴有瘢痕的纤维化和蜂窝样病变,与轻微或正常肺组织呈局灶状交替分布.这些组织病理改变主要累及周围胸膜下肺实质或小叶间隔旁.肺实质炎症通常较轻,由淋巴细胞和浆细胞引起的肺泡间隔浸润所组成,斑片状分布,并伴有Ⅱ型肺泡上皮细胞和支气管黏膜的上皮细胞增生.纤维化病变区主要有致密的胶原瘢痕,散在的增殖型成纤维细胞和肌成纤维细胞集合灶,即成纤维细胞灶(fibroblastic foci,FF)[1].IPF是以弥漫性肺泡炎、Ⅱ型肺泡上皮和血管内皮增生以及肺间质纤维化为主要病理特征[2].越来越多的证据表明[3]:IPF的病理变化源于肺泡上皮受损和修复,异常分布广泛的成纤维细胞灶是损伤和修复的主要部位.肺泡上皮细胞损伤可导致纤维细胞表型转变.
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平滑肌肌动蛋白(SMA)在胆道愈合过程中的表达及意义
目的 观察SMA及肌成纤维细胞在胆道愈合过程中的表达,探讨其在医源性胆管狭窄形成过程中的作用及意义.方法 通过制作犬肝外胆管损伤修复模型,分别于术后1周、3周、3月、6月取材行SMA免疫组化SP染色观察.结果 SMA表达于肌成纤维细胞浆,术后1周至6月表达均较强.肌成纤维细胞功能活跃,细胞外基质过度沉积.结果 导致瘢痕性挛缩,管腔狭窄.结论 SMA及肌成纤维细胞是导致胆道瘢痕性挛缩的主要原因.
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转化生子因子β1对培养心脏成纤维细胞α-SMA及Cx43表达的影响
目的:本研究拟观察转化生子因子β1(TGFβ1)诱导乳鼠CFs向MFs分化中α-SMA及Cx43表达的影响.方法:酶解-差速贴壁分离法分离培养乳鼠CFs,将10 ng/mL的TGFβ1诱导培养第1天细胞;细胞免疫荧光及共聚焦纤维观察α-SMA及Cx43表达;以免疫印迹和RT-PCR分别半定量比较两者α-SMA及Cx43蛋白和mRNA表达.结果:分离培养2d的原代CFs细胞极少表达α-SMA及Cx43蛋白及其mRNA;经TGFβ1诱导24 h后α-SMA及Cx43蛋白及其mRNA表达显著增高(P＜0.01).结论:TGFβ1可诱导乳鼠CFs向MFs分化,导致α-SMA及Cx43蛋白及其mRNA表达显著增高.
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雷公藤内酯醇减少放射性肺纤维化中肌成纤维细胞活化与抑制TGF-β1/ERK/Smad3通路相关
目的 通过体内外实验,观察雷公藤内酯醇(TPL)减少放射性肺纤维化中肌成纤维细胞(MFBs)活化与TGF-β1/ERK/Smad3通路的相关性.方法 以TGF-β1刺激成纤维细胞建立体外MFBs活化模型,C57BL/6小鼠胸部照射形成体内MFBs活化、放射性肺纤维化模型.MFBs活化状态通过检测小鼠成纤维细胞中α-SMA(RT-PCR、Western blot方法)和Col Ⅰ(RT-PCR、ELISA方法)的表达,通路活性采用Western blot法检测p-ERK、p-Smad3(Ser208)、p-Smad3(Ser423)的水平.ERK siRNA及Smad3 siRNA观察ERK、Smad3在MFBs活化中的地位.结果 TGF-β1激活p-ERK/p-Smad3(Ser208)及p-Smad3(Ser423),诱导成纤维细胞表达α-SMA,活化为MFBs,合成Col I明显增多;使用ERK siRNA及Smad3 siRNA确定了ERK及Smad3均参与α-SMA、Col Ⅰ的表达,其中ERK可能通过磷酸化Smad3连接区(Ser208)起相关作用.小鼠胸部照射可致肺组织中p-ERK、p-Smad3(Ser208)、p-Smad3(Ser423)的水平上调,α-SMA表达增加,显示多量MFBs活化.TPL对体内和体外实验中ERK、Smad3(Ser208)、Smad3(Ser423)的磷酸化活化均有明显抑制作用,可明显下调α-SMA表达及Col Ⅰ合成,减少MFBs的活化.结论 TPL可通过抑制TGF-β1/ERK/Smad3通路,减少肺部照射后MFBs活化,从而抑制放射性肺纤维化进展.
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黄芩素对TGF-β1体外诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的影响
目的 观察黄芩素(黄芩苷元,baicalein,BAE)对TGF-β1体外诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的影响.方法 体外培养人胚胎肺成纤维细胞(WI-38),TGF-β1诱导后,通过Western blot 检测细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)相关蛋白表达的变化,同时采用免疫组化法观察细胞形态变化.TGF-β1体外诱导肺成纤维细胞WI-38 成肌成纤维细胞模型,再给予不同剂量的黄芩素,检测转化过程中相关蛋白α-SMA、collagen 1、Smad 2、p-Smad 2 的表达变化.结果 与模型组相比,黄芩素2 000 nmol·L-1～125 nmol·L-1对TGF-β1体外诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化有抑制作用.黄芩素组以剂量依赖性下调α-SMA(P<0.01)、collagen 1(P<0.01)、Smad 2(P<0.05)、p-Smad 2(P<0.05)蛋白的表达.结论 黄芩素对TGF-β1体外诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化过程中有一定的抑制作用,该作用与下调α-SMA,抑制细胞内胶原合成及干预TGF-β/Smads 信号通路有关.
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全反式维甲酸对HFL-Ⅰ细胞α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原、热休克蛋白47表达的影响
目的 研究全反式维甲酸(ATRA)对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人胚肺成纤维细胞(HFL-Ⅰ)中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),Ⅰ型胶原(Collagen-Ⅰ),热休克蛋白47(HSP47) mRNA和蛋白表达的影响.方法 体外培养HFL-Ⅰ细胞,MTT法检测不同浓度TGF-β1和ATRA分别作用3 d对HFL-Ⅰ细胞增殖能力的影响.随后分为6组:对照组、5 μg·L-1 TGF-β1组、10 μmol·L-1 ATRA组、5 μg·L-1 TGF-β1+0.1 μmol·L-1 ATRA组、5 μg·L-1 TGF-β1+1 μmol·L-1 ATRA组、5 μg·L-1 TGF-β1+10 μmol·L-1 ATRA组,RT-PCR和Western blot方法分别检测各实验组细胞中α-SMA,Collagen-Ⅰ,HSP47 mRNA和蛋白的表达.结果 ① MTT法检测结果显示不同浓度的TGF-β1可刺激HFL-Ⅰ细胞增殖,呈浓度依赖性(P<0.05);不同浓度的ATRA对HFL-Ⅰ细胞增殖能力均有明显抑制作用,并随药物浓度的增加而增强(P<0.05).② 5 μg·L-1 TGF-β1诱导后,HFL-Ⅰ细胞中α-SMA,Collagen-I,HSP47 mRNA和蛋白表达均明显上调(P<0.05).③ ATRA以浓度依赖性方式下调经TGF-β1诱导的HFL-Ⅰ细胞中α-SMA,Collagen-I,HSP47 mRNA和蛋白的表达(P<0.05).结论 ATRA能够抑制TGF-β1诱导的HFL-Ⅰ细胞的分化,其作用机制可能与降低Collagen-I、HSP47表达有关.
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黄芪有效部位群对大鼠肌成纤维细胞增殖移行及胞内Smads蛋白磷酸化的影响
目的 研究黄芪有效部位群(effective fractions of astragalus,EFA)对转化生长因子-β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)诱导的大鼠肌成纤维细胞(myofibroblast,MFB)增殖、移行及胞内Smads蛋白磷酸化的影响.方法 采用MTT法观察EFA不同浓度对新生小牛血清(NBS)或TGF-β1诱导的MFB细胞增殖的影响;浸润小室法观察EFA对TGF-β1诱导的MFB细胞移行的影响;免疫吸附和Western blot法研究EFA对TGF-β1诱导的MFB细胞内Smads蛋白磷酸化的影响.结果 EFA(10～160 mg·L-1)呈浓度依赖性抑制NBS及TGF-β1诱导的MFB细胞增殖;EFA(80 mg·L-1)能明显抑制TGF-β1诱导的MFB细胞移行;EFA(10～80 mg·L-1)呈浓度依赖性抑制TGF-β1诱导的MFB细胞内Smad2C 、Smad2L蛋白磷酸化,但各组间Smad2/3蛋白表达水平无差别.结论 EFA通过干扰TGF-β/Smad信号转导通路而抑制MFB细胞的增殖、移行从而起到抗肝纤维化的作用.
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Lin28B/let-7d 环路调控成纤维细胞功能参与肺纤维化发生
目的：研究 Lin28B／let-7d 环路诱导肺成纤维细胞增殖、分化的作用及分子机制，为临床肺纤维化的治疗提供新的策略。方法气管注射博来霉素（bleomycin，BLM）造成小鼠肺纤维化模型；血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）及转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β1诱导人胚肺成纤维细胞（MRC-5）纤维性变；qRT-PCR 检测组织及细胞中 Lin28B、collagen 1α1、collagen 3α1变化；Western blot 检测 Lin28B 蛋白表达；MTT、Edu 染色和免疫荧光实验分别检测细胞活力、增殖及成纤维细胞向肌成纤维细胞的转变。结果Lin28B在肺纤维化小鼠和细胞中表达明显升高。Lin28B 可诱导MRC-5细胞胶原合成增加，而过表达 let-7d 则减轻 Lin28B的这一作用。进一步研究发现，Lin28B 可诱导成纤维细胞增殖，并促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转变，这一作用是通过抑制 let-7d 来实现的。结论Lin-28B 通过抑制 let-7d进而促进成纤维细胞增殖、分化，终增加成纤维细胞胶原合成，诱发肺纤维化的发生，Lin28B 可能作为肺纤维化的治疗新靶点。
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硫氧环蛋白过氧化物酶1对矽肺大鼠肺纤维化的影响
目的 探讨硫氧环蛋白过氧化物酶1(Prx-1)对矽肺大鼠肺组织纤维化的影响.方法 健康成年雄性SD大鼠按抽签法随机分为4组:对照组(生理盐水)、SiO2组(50 mg/只)、SiO2+空慢病毒组(空慢病毒滴度5×107 TU)和SiO2+-Prx-1慢病毒组(Prx-1慢病毒滴度5×107 TU),每组10只.气管内注入SiO2和慢病毒,造模后饲养4周.HE染色观察肺组织形态学变化、免疫组化法检测α-SMA表达,Western blot法检测肺组织Prx-1及Ⅰ和Ⅲ型胶原水平、硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)水平.结果 ① SiO2+Prx-1慢病毒组的Prx-1蛋白表达明显高于SiO2+空慢病毒组,差异有统计学意义(P<0.05);② 对照组大鼠肺组织结构基本正常;SiO2组和SiO2+空慢病毒组大鼠肺泡壁增厚或断裂,细胞性矽结节形成;但SiO2+Prx-1慢病毒组大鼠肺泡壁变薄,矽结节体积减小;③ 与对照组比较,SiO2组α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白 、Ⅲ型胶原蛋白及MDA表达水平均明显增加,差异有统计学意义(P<0.05).SiO2+空慢病毒组的α-SMA、Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白及MDA表达水平与SiO2组无明显区别;但与SiO2+空慢病毒组比较,SiO2+Prx-1慢病毒组的α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白 、Ⅲ型胶原蛋白及MDA表达水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05).结论 Prx-1能够抑制SiO2诱导的肺组织纤维化,这一作用与降低ROS、抑制肌成纤维细胞分化有关.
关键词： 矽肺 活性氧 肌成纤维细胞 硫氧环蛋白过氧化物酶1 -
Hh信号通路在慢性肝脏损伤修复中的作用
Hh信号通路早是在果蝇体内发现的一条高度保守的信号通路[1],随着研究的深入,目前发现该信号通路在脊椎动物体内也相当重要,它能够调节胚胎时期组织、器官的形成以及多种成人组织损伤修复反应,其中也包括肝脏[21.近年来,大量的研究证实在正常的肝脏中Hh信号通路保持抑制状态[ 3],而当受到病毒、药物、酒精等损伤因素持续作用后,产生大量的Hh配体蛋白并激活Hh信号通路H,而激活的Hh信号通路则参与肝脏损伤修复过程中的多个方面,包括各种类型细胞的增殖及凋亡、肌成纤维细胞的转换和聚集、与修复相关的炎症反应以及肝内血管的新生、改建,甚至肝纤维化、肝硬化的形成.
关键词： Hedgehog 肝纤维化 肌成纤维细胞 上皮-间质表型细胞转换 -
ALK7在高糖诱导的心肌成纤维细胞转化及Ⅰ型胶原合成中的作用
目的 研究高糖诱导的心肌间质纤维化(心肌成纤维细胞表型转化以及胶原分泌)过程中活化素受体样激酶7(ALK7)的作用.方法 体外高糖培养大鼠心肌成纤维细胞,免疫荧光法观察成纤维细胞表型转化,real time-PCR法检测心肌成纤维细胞ALK7和Ⅰ型前胶原mRNA的表达水平,ELISA法检测心肌成纤维细胞分泌Ⅰ型胶原水平,Western-blotting法测定心肌成纤维细胞ALK7蛋白的表达水平；siRNA抑制ALK7表达,再次观察高糖对心肌成纤维细胞表型转化及上述各因子表达的影响.结果 高糖刺激心肌成纤维细胞转化为肌成纤维细胞；高糖促进Ⅰ型胶原mRNA和蛋白的表达(P＜0.05)；高糖促进成纤维细胞ALK7 mRNA和蛋白的表达(P＜0.05)；ALK7 siRNA抑制ALK7的表达后,高糖促进心肌成纤维细胞转化及合成Ⅰ型胶原的作用下降(P＜0.05).结论 ALK7参与了高糖诱导的心肌成纤维细胞表型转化及合成Ⅰ型胶原的代谢过程.
