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基因表达谱芯片技术筛选HCTP4反式调节基因
目的:应用基因表达谱芯片研究丙型肝炎病毒核心(HCVcore)蛋白的反式调节基因HCTP4作用的靶基因.方法:构建HCTP4基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-HCTP4,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-HCTP4转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞系)细胞和转染空载体的相同细胞差异表达的mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染HCTP4后,有104条差异基因表达,其中54条基因表达增强,50条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞的增生、分化及细胞的信号转导密切相关.结论:HCTP4是一种病毒反式激活蛋白,对于肝细胞基因表达谱有显著影响,与细胞的增生、分化及细胞的信号转导密切相关,在HCV的致病过程中有重要作用.
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应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选HCVp7蛋白的反式调节基因
目的:构建丙型肝炎病毒HCV p7蛋白反式激活相关基因差异表达的差异cDNA,克隆HCV p7蛋白反式激活相关基因.方法:以HCV p7表达质粒pcDNA3.1(-)-p7转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并合成cDNA,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人HCV p7蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA.扩增后得到56个200-1000 bp插入片段的克隆,随机挑选其中33个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得15种编码基因,其中1个为未知功能的新基因.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括与细胞生长调节、物质代谢、和细胞凋亡密切相关的一些蛋白编码基因.
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应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活的相关基因
目的:应用抑制性消减杂交技术(SSH)构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式激活的相关基因cDNA消减文库,克隆HCV NS3反式激活相关基因.方法:以HCV NS3表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:文库扩增后得到70个白色克隆,经菌落PCR分析,得到56个200-1 000 b插入片段.对所得片段测序,并进行同源性分析,获得6个差异表达的未知序列,可能是NS3反式激活的新的靶基因.结论:成功构建HCV NS3反式激活的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础.
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应用表达谱芯片技术对截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式调节基因的研究
目的:应用基因表达谱芯片研究乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原截短型中蛋白(MHBst)的反式调节基因.方法:构建MHBst基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-MHBst,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-MHBst转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞系)细胞和转染空载体的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染MHBst后,有37条差异基因表达,其中14条基因表达增强,23条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞的增生、分化及细胞的信号转导密切相关.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了乙型肝炎病毒表面抗原截短型中蛋白的反式调节基因,为进一步阐明乙型肝炎病毒表面抗原截短型中蛋白的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.
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应用抑制性消减杂交技术克隆HCV NS3蛋白反式激活基因2的上调基因
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)NS3蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCV NS3蛋白反式激活相关基因.方法:以HCV NS3表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并合成cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人HCV NS3蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到61个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到100-1 000bp插入片段.挑取30个插入片段测序分析,得到30个已知功能基因序列.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码因,推测了NS3TP2可能存在的调控机制的线索.
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应用表达谱芯片技术对NS5ATP7反式调节基因的研究
目的:应用基因表达谱芯片研究丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白7(human gene 7 transactivated bynonstructural protein 5A of hepadtis C virus,HCV NS5ATP7)的反式调节基因.方法:构建NS5ATP7基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP7,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-NS5ATP7转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞系)细胞和转染空载体pcDNA3.1(-)的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染NS5ATP7后,有12条差异基因表达,其中4条基因表达增强,8条基因表达降低.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了NS5ATP7的反式调节基因,为进一步阐明NS5ATP7的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.
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应用表达谱芯片技术对丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式调节基因的研究
目的:应用基因表达谱芯片研究丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)的反式调节基因.方法:构建NS5A基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-NS5A转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞系)细胞和转染空载体的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染NS5A后,有54条差异基因表达,其中28条基因表达增强,26条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞的增生、分化及细胞的信号转导密切相关.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了丙型肝炎病毒非结构蛋白5A的反式调节基因,为进一步阐明丙型肝炎病毒非结构蛋白5A的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.
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两种启动子调控下PNP基因载体的构建和差异性表达
目的:分别构建巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)通用启动子和甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)杂合启动子[HRE]AF调控的PNP基因表达载体并检测、分析二者的差异表达.方法:将[HRE]AF启动子插入载体pcDNA3.0,构建肝癌细胞特异表达载体p[HRE]AF;将PNP基因分别插入pcDNA3.0和p[HRE]AF,构建两种启动子调控的PNP基因表达载体pcDNA3.0/PNP和p[HRE]AF/PNP;经酶切、PCR及测序鉴定各重组体.用脂质体介导法将两PNP基因载体转染不同细胞株,RT-PCR检测PNP基因在各细胞株中表达,分析二者表达的特点.结果:各目的片段均成功插入相应载体中,CMV启动子调控的PNP基因在各株细胞中均实现了表达,而[HRE]AF启动子调控的PNP基因则在AFP阳性和阴性肝癌细胞中实现了组织特异性表达.结论:两PNP基因表达载体是肝癌基因治疗中新型、高效的治疗载体,p[HRE]AF/PNP还实现了在AFP阳性,尤其是AFP阴性肝癌细胞中的靶向性表达.
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胃癌中医证型相关基因的表达谱
目的:寻找不同胃癌证型组织中的相关基因表达谱差异表达,对研究胃癌证型实质进行探讨、胃癌的中医证的基因诊断及指导临床用药有重大的意义.方法:我们运用含有4 096条人类全长基因的cDNA表达芯片技术,对胃癌中医证型邪热内蕴证和气滞血瘀证共4例,胃癌组织及胎胃正常组织基因表达进行了分析.结果:两证型都有免疫相关基因的下降,也有癌基因的上调,但热毒内蕴亚型基因表达提示了正气未虚,尚有防御能力,如nm23基因增高,p18基因表达增高;而气虚夹瘀亚型中则无此改变.结论:胃癌患者的基因表达既有相同表达改变,也有不同中医证型的基因谱表达改变也不相同,基因表达谱可为中医的证型提供科学依据.
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抑瘤基因NGX6对人结肠癌细胞HT-29生长的影响
目的:NGX6是新克隆的侯选抑瘤基因,其在结肠癌组织中表达明显下调,提示NGX6的差异表达与结肠癌发生有关.本文通过研究NGX6对人结肠癌细胞HT-29生物学特性的影响以明确NGX6在结肠癌发生发展中的作用.方法:脂质体介导pcDNA3.1(+)/NGX6重组体转染低表达NGX6的人结肠癌细胞HT-29,Dot blot及RT-PCR方法检测外源性NGX6基因的表达,借助生长曲线、MTT、软琼脂集落形成、流式细胞仪、裸鼠成瘤实验对NGX6转染前后人结肠癌细胞HT-29的生物学行为进行检测.结果:pcDNA3.1(+)/NGX6/HT-29组细胞生长速度比pcDNA3.1(+)/HT-29和HT-29组明显减慢(P<0.05),其倍曾时间为345 h比pcDNA3.1(+)/HT-29(27.1 h)和HT-29(23.0 h)延长;pcDNA3.1(+)/NGX6/HT-29组软琼脂集落形成率较对照组明显下降(P<0.05);流式细胞仪检测NGX6高表达能延缓HT-29细胞周期由G0/G1期→S期的进程;裸鼠成瘤实验表明pcDNA3.1(+)/NGX6/HT-29组成瘤受抑.结论:NGX6的重表达可逆转人结肠癌细胞HT-29的恶性表型;NGX6是极具前途的结肠癌相关抑瘤基因侯选者.
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肠癌细胞株dynamin Ⅱ的差异表达
目的:应用半定量RT-PCR方法检测dynaminⅡ基因在大肠侧向发育型肿瘤细胞株同SW480细胞株及Lovo细胞株之间的差异表达.方法:以三种肠癌细胞株为标本,分别提取总RNA,逆转录合成cDNA,选择加入的模板量及循环数,优化PCR反应条件,确定适宜的反应体系,凝胶图像分析结果.结果:在大肠侧向发育型肿瘤细胞株同普通隆起型肠癌细胞株之间存在着dynaminⅡ基因的差异表达.结论:半定量RT-PCR方法具有简单,方便,经济的特点,通过该方法,我们发现在大肠侧向发育型肿瘤癌细胞株同SW480细胞株及Lovo细胞株之间存在dynaminⅡ基因的差异表达,此结果同我们基因芯片的筛选结果一致,结合dynaminⅡ基因的功能,我们推测该基因可能在LST的形态学或癌变机制中发挥一定作用.
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幽门螺杆菌对人肝细胞系HepG2细胞蛋白质组的影响
目的:初步观察Hpylori对人肝细胞系HepG2蛋白质的差异表达,为进一步探讨Hpylori对肝细胞的病理作用机制奠定基础.方法:将Hpylori与HepG2共同培养6 h,采用双向电泳技术,对Hpylori处理和未处理HepG2细胞蛋白质进行分离和比较分析.结果:图像分析探测到Hpylori处理前后HepG2 2-DE图谱的平均蛋白质点数分别为988±94个、996±68个,蛋白质点的匹配率为86.4%.发现对照和H pylori处理HepG2蛋白表达有明显差异,主要是蛋白表达量的增加和减少,其中在Hpylori处理后有10种蛋白(Mr/pI:91 326/6.21,90 640/6.68,87 833/5.65,81 139/6.55,63 805/6.24,60 445/7.38,47 592/5.28,46 293/7.21,43 415/7.64,21 704/5.66)表达增强,8种蛋白(Mr/pI:70 839/7.02,56 403/6.58,44 076/6.86,43 744/7.21,42 497/6.64,37 567/7.17,22 342/7.49,21 112/5.63)表达降低.结论:Hpylori处理前后HepG2的蛋白质组具有差异,这些差异表达的蛋白质可能参与了Hpylori对肝细胞的病理作用过程,这种蛋白质组的差异分析有助于进一步研究Hpylori与人类肝脏疾病的关系.
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羊急性心梗卸负荷模型miRNA表达差异的初步分析
目的 对羊急性心梗卸负荷模型的microRNA表达谱进行初步差异分析,探索LVAD卸负荷的调控机制.方法 根据microRNA表达谱筛选出差异表达miRNA,用靶基因预测软件PITA、miRanda得到差异表达miRNA的靶基因,通过GO数据库和KEGG数据库对靶基因进行GO注释和KEGG pathway分析.结果 筛选得到卸负荷组与对照组相同表达miRNA 3个,差异表达miRNA 22个.其中miR-21、miR-26a、miR-30c、miR-125b与心肌细胞凋亡调控相关,miR-30a-3p可能与缺氧后心肌细胞自噬相关,miR-218a、miR-541-5p可能与肥厚性心肌调节相关,13个miRNA未见与心梗相关的报道.GO和KEGG分析发现差异miRNA靶基因富集的生物功能和信号通路与LVAD卸负荷作用密切相关.结论 通过对microRNA表达谱的差异分析,发现了9个参与卸负荷作用调节和13个未知功能的microRNA表达,为进一步深入分析急性心梗的调控网络提供了一个新的线索.
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HBV相关肝纤维化患者血浆microRNA的差异表达
目的 探索microRNA在乙型肝炎肝纤维化患者血浆中的差异表达.方法 收集2013年至2014年本院收治的经肝组织活检诊断为肝纤维化S2~S3期的患者10例、代偿期肝硬化患者8例,另选取8例健康志愿者作为对照组,采用IlluminaHiSeq测序技术检测各组血浆miRNA表达,对差异表达的miRNA进行聚类分析和靶基因预测;对差异表达miRNA靶基因进行基因本(GO)分析和KEGG通路富集分析.结果 与健康对照组相比,肝纤维化组筛选出104个差异miRNA,其中72个表达上调,32个表达下调;肝硬化组筛选出102个miRNA,其中70个表达上调,32个表达下调.两组中均显著上调的共22个,均显著下调的共24个,在上调的miRNA中,共9个miRNA在肝硬化组表达量高于肝纤维化组;下调的miRNA在肝纤维化组与肝硬化组的表达无显著差异.结论 肝纤维化患者血浆miRNA表达与健康组有显著差异,这些差异表达的miRNA在肝纤维化进展中起着重要作用,其可能参与肝纤维化发生发展过程中某些信号通路的调控,确切机制尚需进一步深入研究.
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slp-76基因在肝癌及其他消化系统肿瘤中的差异表达分析
目的 分析slp-76基因在肝癌、食管癌、贲门癌、胃癌、结肠癌及其癌旁组织中的表达情况.方法 应用微阵列技术筛选出slp-76基因在肝癌组织中高表达,以逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)技术对上述消化系统肿瘤组织及其癌旁组织中的slp-76基因表达进行检测;应用Northern blot技术对肝癌组织及其癌旁组织中的slp-76基因表达进行检测.结果 RT-PCR证实slp-76在79.3 %(24/29)的肝癌组织中高表达( P = 0.005);在73.3 %(22/30)的食管癌组织中高表达( P =0.005);在75 %(21/28)的贲门癌组织中高表达( P = 0.014);在75 %(15/20)胃癌组织中高表达( P = 0.005);在72.2 %(13/18)结肠癌组织中高表达( P = 0.008);Northern blot 证实slp-76基因在肝癌组织中呈高水平表达.结论 slp-76基因在消化系统肿瘤中高表达,slp-76与上述消化系统肿瘤生长关系密切;在RNA水平,该基因在上述肿瘤间的表达无显著性差异( P = 0.968).
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致心律失常型右心室心肌病的分子遗传学研究和临床诊断进展
致心律失常型右心室发育不良/心肌病(arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy/dysplasia,ARVC/D)是一种常染色体显性遗传心肌病,虽然临床上较少见,却是35岁以下运动员猝死的常见病因.主要累及右心室,病理特征为右心室心肌萎缩,被纤维、脂肪组织替代,而室间隔相对很少受累.主要发生于年轻人或运动员,心室电不稳定,易发生室性心动过速或心室颤动,可致猝死.疾病进展到后期时,右心室心肌病变加重,可累及左心室导致心力衰竭.起初认为病因为右心室心肌发育缺陷所致,因此命名为"发育不良".这种观念沿用了25年,现在认为是遗传因素导致的心肌病[1],超过50%的患者有家族史.这种疾病通常为常染色体显性遗传,伴有不完全外显和差异表达.
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肝癌差异表达基因研究进展(文献综述)
目前发现大量的癌基因、抑癌基因,或相关基因参与肝癌的发生、发展,在肝癌组织、癌旁肝组织、正常肝组织之间,在RNA、蛋白水平都存在众多的差异表达基因,认识这些基因及其转录、调控的分子机制,对于揭示肝癌的发病机制具有重要意义,本文就该领域的研究进展进行综述.
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S100A4基因的差异表达与肺癌的分化和转移
提取46对肺癌及正常组织配对标本和肺癌细胞系A549、GLC-82、NCI-H446、NCI-H460的总RNA,用RT-PCR测定S100A4基因的表达,并结合临床资料,对S100A4基因表达与肺癌病人临床表现的相关性进行分析.
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小鼠皮肤无绿藻感染差异表达基因的筛选
目的 利用基因表达谱芯片筛选小鼠感染无绿藻皮肤组织的差异表达基因,探讨基因在皮肤无绿藻病中的作用,从而对皮肤无绿藻病有更新的认识.方法 12只6~8周龄雄性小鼠,随机分为两组,实验组(皮肤无绿藻感染组)和对照组(生理盐水组)各6只;分别提取免疫抑制小鼠感染无绿藻的皮肤组织和对照组皮肤组织,抽提总RNA,反转录成cDNA同时进行单色标记,和小鼠全基因表达谱芯片杂交,经过芯片扫描和数据处理,分析出差异表达的基因,并对部分差异基因采用实时荧光定量PCR的方法进行验证.结果 感染无绿藻的小鼠皮肤组织中表达差异>2倍的基因共有9902个,其中表达上调的基因4974个,表达下调的基因4928个;生物信息学分析发现,差异基因功能主要涉及炎症反应、免疫应答、信号转导、细胞黏附等多个生物学过程;另外还发现了一些有意义的信号通路如趋化因子信号通路、Jak-STAT信号传导途径、Toll样受体信号传导途径等;差异基因的实时荧光定量PCR结果与基因芯片的结果趋势一致.结论 皮肤无绿藻病的发生涉及众多基因表达的改变,芯片技术可以有效地筛选出皮肤无绿藻感染小鼠的差异表达基因,对进一步探索皮肤无绿藻病的发病机制,有效干预或治疗皮肤无绿藻病具有重要意义.
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不同耐药表型鲍氏不动杆菌的蛋白质表达图谱的建立研究
目的 采用经典的二维电泳方法建立不同耐药表型鲍氏不动杆菌的蛋白质差异表达图谱,为后续从整体水平探讨耐药机制奠定试验基础.方法 对来自医院临床分离并鉴定的不同耐药表型鲍氏不动杆菌采用VITEK-2 Compact进行药敏检测,同时用纸片扩散法(K-B法)检测头孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、米诺环素的敏感性;按药敏试验表型分为:全耐药菌株、全敏感菌株、头孢哌酮/舒巴坦及米诺环素敏感菌株;然后进行二维电泳,之后用Bradford法进行蛋白点的显色.结果 与全敏感鲍氏不动杆菌相比,其余耐药表型有3个共同蛋白点表达明显减低或是缺失,同时有1个共同蛋白点表达明显增加;头孢哌酮/舒巴坦敏感菌株与全耐药菌株和米诺环素敏感菌株相比,在某个区域存在多个差异蛋白点;米诺环素敏感菌株与全耐药和头孢哌酮/舒巴坦敏感菌株相比,在另外区域也存在多个差异蛋白点.结论 初步建立了不同耐药表型的鲍氏不动杆菌双向电泳图谱,为后续的差异蛋白的鉴定和功能研究提供了试验依据.