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他克莫司原位胶化滴眼剂的制备及质量控制
他克莫司(tacrolimus,FK506)是1984 年日本学者在筑波地区从土壤真菌中提取的一种大环内酯类新型免疫抑制剂,是通过抑制相关细胞因子的活性来抑制淋巴细胞活化.目前临床上已得到广泛的应用, 经他克莫司治疗的角膜植片,排斥反应的相关因子和细胞表达明显降低[1].但其全身用药在眼科受到限制,常规的局部用药生物利用度低,难于在眼内达到或维持有效浓度.我们根据临床需要研制了他克莫司原位胶化滴眼剂,并进行质量控制,现报告如下.
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白芍总苷对小鼠淋巴细胞体外增殖活化影响的研究
目的:白芍总苷(total glucosides of paeon,TGP)对小鼠脾淋巴细胞增殖、活化标志CD69和CD25及细胞因子IL-4及IFN-γ的影响,为阐明TGP免疫抑制提供分子药理学依据.方法:无菌分离小鼠脾淋巴细胞,加入不同浓度的TGP溶液,MTT法检测ConA刺激的小鼠脾淋巴细胞增殖；流式细胞仪检测活化标志CD69及CD25；酶联免疫法检测细胞因子IL-4及IFN-γ.结果:TGP对脾淋巴细胞增殖活化及分泌均有抑制作用.
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抗原致敏的脐血树突状细胞诱导抗肿瘤效应的体外实验研究
树突状细胞(Dendritic cell,DC)连接先天和适应性免疫.其特点是捕获抗原和加工,迁移到淋巴器官和表达抗原特异性淋巴细胞活化的各种共刺激分子的能力强[1].
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IL-21在HBV感染中的作用
IL-21是一种活化的CD4+T淋巴细胞分泌的细胞因子,能够影响各种淋巴细胞的功能.值得注意的是,IL-21介导的细胞和体液免疫应答在决定病毒感染的结局方面起着重要作用.介绍了关于IL-21在HBV感染中起重要作用的研究进展.病毒特异性CD4+T淋巴细胞分泌的IL-21在维持CD8+T淋巴细胞应答和促进B淋巴细胞应答方面起着关键作用,对于有效地控制病毒至关重要.然而,IL-21作为炎症介质也参与乙型肝炎相关肝硬化的发展和肝损伤的加重.因此,认为在HBV感染中IL-21是一种免疫调节细胞因子.免疫治疗策略的目的是在HBV感染中优化IL-21的有益作用,这在未来可能是一个严峻的挑战.
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基于细胞计数试剂盒8的药物淋巴细胞刺激试验在急性药物性肝损伤诊断中的应用
目的 建立一种基于细胞计数试剂盒8(CCK-8)法的药物淋巴细胞刺激试验(DLST)并应用于急性药物性肝损伤(DILI)的诊断.方法 筛选2011年1月-2014年12月北京佑安医院收治的急性DILI患者,收集导致肝损伤的可疑药物,分离外周血单个核细胞(PBMC),经体外培养后,与可疑药物共孵育,采用CCK-8法检测淋巴细胞的增殖程度.每次实验设阳性对照组,以植物血凝素进行刺激;同时以健康人的PBMC暴露于相同药物,同步检测作为阴性对照.将DLST结果引入RUCAM评分系统,评估对急性DILI诊断敏感性的影响.计数资料组间比较采用x2检验.结果 预实验确定了CCK-8法DLST的实验条件.共纳入61例急性DILI患者,其中52例75种药物完成了基于CCK-8法的DLST检测,48例70种药物结果可靠,共19例22种药物DLST阳性,患者和药物的阳性率分别为39.6％和31.4％,特异性为93.8％,38.2％ (13/34)的中药和25.0％ (9/36)的西药的DLST结果为阳性,刺激指数中位数为2.29(1.81～14.20).将DLST结果引入RUCAM评分系统,可将评估结果为“极可能”和“很可能”的药物由74.7％提高至92.0％ (x2 =8.112,P=0.004).结论 利用CCK-8法可进行DLST,将DLST结果引入RUCAM评分系统可显著提高对DILI诊断的敏感性.与经典DLST相比,这种基于CCK-8法的DLST实验室要求低,操作简便、快捷,且花费更低,可在临床进一步使用验证.
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LIGHT-HVEM-BTLA共信号分子的研究进展
BTLA是新近发现的一个CD28 超家族共抑制分子,它的配体不是B7家族成员而是TNF受体超家族成员 HVEM.HVEM同时还存在一个TNF超家族的配体,即T细胞上可诱导表达的与HSV的糖蛋白D竞争结合HVEM的淋巴毒素类似物(LIGHT).HVEM可以作为一个分子开关,通过结合LIGHT或BTLA在免疫调节中发挥不同的作用.
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雌二醇对小鼠正常淋巴细胞和致敏淋巴细胞活化的调节
为探讨雌二醇(E2)对正常和致敏淋巴细胞活化的调节作用,并分析了E2对ConA活化的小鼠正常和致敏淋巴细胞增值、抗体产生及TGF-β生成的影响.结果显示生理水平尤其是相当于小鼠动情间期水平的E2对致敏脾淋巴细胞增殖具有明显促进作用;对初始脾淋巴细胞增殖没有影响.较高水平E2诱导活化的脾细胞生成TGF-β,促进免疫鼠脾细胞生成特异性抗体;较低水平E2抑制特异性抗体生成,且抑制程度与脾细胞活化状态相关.
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FOXP3在炎症性肠病患者外周血和肠黏膜中的表达特点
背景:炎症性肠病(IBD)的发病与一系列免疫异常有关.免疫反应受特定的免疫调节细胞调控,包括CD4+CD25+T细胞,而CD4+CD25+T细胞的发育和功能可能受FOXP3基因调控.目的:研究FOXP3的表达特点以及IBD时FOXP3表达的改变.方法:以免疫磁珠分离CD4+、CD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞.以逆转录聚合酶链反应(RTPCR)和蛋白质印迹法检测IBD患者和非IBD对照外周血单个核细胞(PBMC)、肠固有层单个核细胞(LPMC)和肠黏膜组织中FOXP3的表达.结果:CD4+CD25+T细胞中FOXP3 mRNA的表达明显强于CD4+T细胞和未分离的PBMC或LPMC.T细胞受体(TCR)激活后,或经白细胞介素(IL)-2、IL-15作用后,PBMC或LPMC FOXP3 mRNA或蛋白表达明显增强.12例IBD中9例(75.0%)肠黏膜LPMC中检测到FOXP3 mRNA表达,高于对照肠黏膜的47.1%(8/17,P＞0.05).未受刺激的IBD和对照肠黏膜组织中未检测到FOXP3 mRNA表达.结论:人类FOXP3的表达受T细胞活化影响.IBD患者肠黏膜LPMC中FOXP3 mRNA的表达率有增高的趋势,但与对照肠黏膜相比无显著差异.
关键词： FOXP3 炎性肠疾病 CD4阳性T淋巴细胞 淋巴细胞活化 -
地塞米松调节T细胞免疫应答保护小鼠急性炎性肝损伤的作用
背景：在小鼠急性炎性肝损伤中，地塞米松（Dex）可通过抑制天然免疫细胞功能抑制肝损伤进展，然而 T 细胞是否参与此保护作用尚少见报道。目的：探讨 Dex 在急性炎性肝损伤中对 T 细胞免疫应答的调节效应。方法：6只雄性 C57BL/6J 小鼠随机分为实验组和模型组，在以脂多糖诱导急性炎性肝损伤模型前1 h，两组分别腹腔注射 Dex 5 mg/ kg 和等体积 PBS。建模12 h 后处死小鼠，行临床评分并检测肝功能；分离脾脏单个核细胞，分析 T 细胞活化情况以及各 T 细胞亚群的细胞因子表达、分泌和转录因子表达。结果：实验组小鼠临床评分和血清转氨酶水平均明显低于模型组，脾脏 CD44+ CD62L - T 细胞（活化或记忆性 T 细胞）比率显著降低，Th1型细胞因子 IFN-γ表达、分泌减少，Th2型细胞因子 IL-4表达、分泌增加，调节性 T 细胞（Treg 细胞）比率、Th2/ Th1、Treg/ Th1比值增加；同时，Th1细胞特异性转录因子表达下调，Th2、Treg 细胞特异性转录因子表达上调。结论：Dex 通过抑制 T 细胞活化并调节 T 细胞亚群分化（抑制 Th1细胞分化，促进 Th2、Treg 细胞分化），在急性炎性肝损伤中起一定保护作用。
关键词： 肝损伤 地塞米松 淋巴细胞活化 细胞分化 Th1-Th2 平衡 -
T淋巴细胞亚群的早期活化对乙型肝炎疫苗接种后免疫应答的影响
目的 探讨乙型肝炎疫苗接种后免疫应答与T淋巴细胞亚群活化的关系.方法 采集18例乙型肝炎疫苗接种应答者、22例乙型肝炎疫苗接种无应答者、10例未接受乙型肝炎疫苗接种的健康对照者全血.用流式细胞术对其外周血单个核细胞的表面标志物CD69、CD4、CD8、CD3等进行检测.计算不同T淋巴细胞亚群百分比.并经t检验比较不同T淋巴细胞亚群CD69表达的差异.结果 在应答者中,外周血激活型T辅助淋巴细胞(CD69~+ CD4~+ T淋巴细胞)数明显升高,而CD69~+ CD8~+ T淋巴细胞数则明显减少.应答者、无应答者、对照者外周血CD69~+ CD4~+ T淋巴细胞分别占CD4~+ T淋巴细胞的(1.81±1.33)%、(0.64±0.48)%和(0.56±0.39)%,应答者分别与无应答者和对照者比较.差异均有统计学意义(t=3.444、3.940,均P<0.01).应答者、无应答者、对照者外周血CD69~+ CD8~+ T淋巴细胞分别占CD8~+ T淋巴细胞的(0.43±0.25)%、(3.05±1.69)%和(3.11±2.41)%,应答者分别与无应答者和对照者比较,差异均有统计学意义(t=7.997、5.944,均P<0.01).应答者、无应答者、对照者CD3~+ CD4~+ T淋巴细胞占CD3~+ T淋巴细胞的百分比和CD3~+ CD8~+ T淋巴细胞占CD3~+ T淋巴细胞的百分比比较差异均无统计学意义.结论 乙型肝炎疫苗接种后无应答与Th细胞早期活化不足有关.
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人类免疫缺陷病毒感染者T淋巴细胞亚群增殖、活化与疾病进展的相关性
目的 探讨慢性未治疗HIV/AIDS患者T淋巴细胞增殖活化与疾病进展的相关性.方法 以16例健康人及49例慢性未治疗的HIV/AIDS患者为研究对象,HIV/AIDS患者根据CD4+T淋巴细胞计数分为CD4+T淋巴细胞<200×106/L组、(200～350)X106/L组、>350X106/L组.分离患者外周血单个核细胞(PBMC),Ki-67标记细胞增殖,CD38标记细胞活化,流式细胞仪检测各项指标.数据采用单因素方差分析.结果CD4+T淋巴细胞<200×106/L组Ki-67+CD4+T 淋巴细胞比例为7.92%±4.37%,高于健康对照组的0.39%±0.24%、(200～350)×106/L组的2.61%±2.12%和>350X 106/L组的2.65%±2.13%,差异均有统计学意义(F=21.961,P<0.01);CD4+T淋巴细胞<200X106/L组Ki-67+CD8+T淋巴细胞比例为2.87%±1.13%,高于健康对照组的0.15%±0.90%、(200～350)×106/L组的1.40%±1.17%和>350×106/L组的1.22%±0.80%,差异均有统计学意义(F=19.203,P<0.01).且Ki-67+CD4+和Ki-67+CD8+T淋巴细胞比例与CD4+T淋巴细胞计数呈负相关(r=-0.654,r=-0.539;均P<0.01),而与病毒载量无关.CD4+T淋巴细胞<200×106/L组CD38+CD4+、CD38+CD8+T淋巴细胞比例分别为44.14%±20.65%和50.64%±21.08%,健康对照组为10.22%±3.98%和6.46%±3.99%,(200～350)×106/L组为16.03%±10.20%和19.33%±13.43%,>350×106/L组为13.69%±10.70%和16.98%±15.75%(F=14.333,F=15.412;均P<0.01),且CD4+和CD8+T淋巴细胞Ki-67的表达程度与CD38呈正相关(r=0.527,r=0.391;均P=0.002).结论 随着慢性HIV/AIDs疾病的进展,T淋巴细胞的增殖与活化均显著增高,T淋巴细胞活化可能是免疫持续激活的结果.
关键词： HIV-1 获得性免疫缺陷综合征 T淋巴细胞亚群 细胞分裂 淋巴细胞活化 -
PTD-HBcAg体外诱导小鼠髓源性树突状细胞成熟及在T淋巴细胞增殖中的作用
目的 观察融合蛋白PTD-HBcAg诱导体外培养的小鼠髓源性树突状细胞(DC)成熟及对T淋巴细胞增殖的作用.方法 体外分离培养近交系BALB/C小鼠髓源性DC加入重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rgM-CSF)、重组IL-4培养5 d,再加人TNF-a、HBcAg和PTD-HBcAg诱导DC成熟.激光共聚焦显微镜观察免疫荧光在细胞中的分布及定位,流式细胞计数仪测定DC表面分子表达,ELISA法测定DC培养上清液中IL-12 p70的水平,CCK-8试剂盒检测T淋巴细胞增殖反应.组间数据比较采用t检验.结果 成功体外诱导培养小鼠髓源性DC,HBcAg主要定位于DC膜表面,而PTD-HBcAg能够穿透DC膜进入细胞质.PTD-HBcAg能明显上调DC表面分子CD80、CD86和主要组织相容性复合体(MHC)II类分子表达;50 mg/L和100 mg/L PTD-HBcAg诱导DC分泌IL-12 p70水半分别为(142.50±18.31)ng/L和(124.30±15.12)ng/L,明显高于HBcAg诱导组的(42.31±4.21)ng/L(t=9.234和9.045,均P＜0.05);PTD-HBcAg诱导DC刺激T淋巴细胞增殖能力明显高于HBcAg组及阳性对照TNF-a组.结论 PTD-HBcAg具有穿透DC膜能力,并能促进DC分化、成熟,明显上调表面共刺激分子表达,增强DC刺激T淋巴细胞增殖能力及分泌IL-12 p70的水平.
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CD28家族分子在疾病诊疗中的研究进展
机体免疫应答过程是由多种免疫细胞和免疫分子共同参与完成的,而免疫应答的核心是T淋巴细胞的活化.近年来的研究表明,T淋巴细胞活化、增殖及分化为效应细胞需要双重刺激信号:第一信号由T细胞受体(TCR)转导并由黏附分子增强;第二信号即协同刺激信号,由抗原提呈细胞(APCs)表面的协同刺激分子和T细胞的相应受体作用产生[1].
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活化抗原CD69、HLA-DR在寻常性银屑病外周血单一核细胞和皮损中的表达
目的：探讨活化抗原CD69和HLA-DR在寻常性银屑病患者外周血CD3+T淋巴细胞和皮损中的表达变化。方法流式细胞仪检测20例寻常性银屑病患者和20例健康对照外周血CD3+T细胞中CD69和HLA-DR的表达，同时采用免疫组化的方法检测15例寻常性银屑病患者和10例健康对照皮损组织中HLA-DR的表达并进行对比。两组统计学分析采用双侧t检验。结果 CD69和HLA-DR在寻常性银屑病患者外周血CD3+T细胞中的表达率分别为（4．70±1．90）％、（8．97±1．79）％，比健康对照组[（1．56±0．95）％、（3．02±1．15）％]明显升高（均P<0．01）。Pearson相关性分析发现，CD3+HLA-DR+细胞百分比与银屑病皮损和严重程度评分指数（PASI）评分呈正相关（r=0．5626，P<0．05）。与健康对照组比较，寻常性银屑病患者皮损真皮中HLA-DR表达升高，但表皮中HLA-DR表达降低（均P<0．05），HLA-DR在健康人主要分布在血管周围，而在寻常性银屑病患者则广泛表达于真皮组织。结论寻常性银屑病患者外周血CD3+T淋巴细胞及皮损中的炎症细胞存在异常活化，外周血CD3+HLA-DR+细胞与疾病严重程度存在相关性。
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CD147与P糖蛋白在SLE患者外周血单一核细胞表达
研究发现,CD147分子中存在着调节淋巴细胞活化的抗原决定簇,且细胞上CD147的表达水平与细胞的活化状态有关,活化的T淋巴细胞上CD147表达上调~([1]).有文献报道~([2]),活动性高的SLE患者易发生对糖皮质激素不敏感现象,且其活化的外周血淋巴细胞上P糖蛋白的表达明显高于正常对照.
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杨梅素对淋巴细胞活化及增殖的影响
目的研究杨梅素(myricetin)对小鼠T细胞活化及增殖的影响,探讨其作为免疫调节药物开发的可能性并提供相关实验依据.方法无菌分离小鼠淋巴结细胞,加入不同浓度的杨梅素预先孵育1h,用多克隆刺激剂刀豆蛋白(ConA)刺激T细胞活化,利用荧光标记的单克隆抗体双染技术,流式细胞仪检测杨梅素对小鼠CD3+ T细胞CD69表达的影响;采用3H-TdR参入法检测杨梅素对淋巴细胞增殖的影响,采用半定量RT-PCR技术从mRNA水平检测杨梅素对IL-2 mRNA表达的影响.采用ELISPOT检测杨梅素对IFN-γ分泌的影响.结果杨梅素能抑制T细胞早期活化标志CD69的表达,并能抑制淋巴细胞增殖反应,同时对淋巴细胞活化后IL-2 mRNA的表达及IFN-γ的分泌也有抑制作用.结论杨梅素对淋巴细胞的活化增殖反应具有抑制作用.
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4-1 BBL介导逆向信号在HL-60细胞对淋巴细胞活性影响中的作用
目的:观察4-1 BBL介导逆向信号对HL-60细胞表达肿瘤生长因子-β(TGF-β)的影响,以及阻断4-1 BB/4-1 BBL信号前后的HL-60细胞培养上清液对淋巴细胞活化、增殖和凋亡诱导作用的影响,探讨肿瘤的免疫逃逸机制.方法:流式细胞术检测HL-60细胞4-1 BBL表达水平和阻断4-1 BBL信号前后HL-60细胞TGF-β表达水平;将阻断4-1 BBL前后的HL-60细胞培养上清液加入淋巴细胞培养液中,流式细胞术检测淋巴细胞活化、凋亡水平,MTT法检测淋巴细胞增殖水平.结果:HL-60细胞表面4-1 BBL表达率为92.6%;阻断4-1 BBL后的HL-60细胞表达TGF-β水平下降(P＜0.05),其细胞培养上清液对淋巴细胞活化没有明显影响(P＞0.05),但对淋巴细胞增殖抑制作用和诱导凋亡作用下降(P＜0.05和P＜0.01).结论:表达在HL-60细胞表面的4-1 BBL可介导逆向信号,通过调节TGF-β分泌抑制机体淋巴细胞活性,为肿瘤细胞的生存创造条件.
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福州地区健康儿童外周血淋巴细胞亚群及主要活化相关指标正常参考范围的建立
目的：建立福州地区健康儿童外周血淋巴细胞亚群及活化的正常参考范围。方法选取福州地区0～18岁健康儿童593例为研究对象，按年龄分为新生儿组（0～28d）、婴儿组（～12个月）、幼儿组（～3岁）、学龄前组（～7岁）、学龄组（～12岁）和少青组（～18岁），采集外周血以美国BD公司生产的四色荧光抗体进行标记，以FACSCalibur流式细胞仪测定T淋巴细胞亚群CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、B淋巴细胞亚群CD3-CD19+、NK细胞CD3-CD16+CD56+及淋巴细胞活化指标CD4+CD38+、CD4+Anti-HLA-DR+、CD8+CD38+、CD8+Anti-HLA-DR+的百分率和绝对计数，以MultiSET软件获取数据并分析结果，SPSS 10.0软件进行统计分析。以百分位数法，采用95%可信区间确定正常参考值范围。结果除CD3-CD16+56+绝对计数在各年龄组间无差异外，淋巴细胞亚群及淋巴细胞活化指标在不同年龄组之间的差异均有统计学意义，表现为CD3+绝对计数、CD3+CD4+、CD4+CD38+百分率和绝对计数、CD4+/CD8+比值随着年龄的增长呈降低趋势。CD4+Anti-HLA-DR+的百分率随着年龄的增长呈增高趋势。新生儿组CD3+、CD3+CD4+、CD4＋CD38＋、CD8＋CD38＋的百分率和绝对计数及CD4＋/CD8＋比值明显高于其它年龄组，CD3-CD19＋、CD8＋Anti-HLA-DR＋的百分率和绝对计数明显低于其它年龄组。在不同性别之间CD3+CD4+和CD3-CD19+、CD4+CD38+、CD4＋Anti-HLA-DR＋和CD8＋CD38＋的百分率和绝对计数的差异有统计学意义，表现为女童明显低于男童。儿童淋巴细胞亚群绝对计数的参考值高于成人。结论健康儿童淋巴细胞免疫表型的分布存在性别和年龄差别，由于这种差别细微，可以在同一种族同一区域建立统一的正常参考值范围。本研究成功建立福州地区健康儿童淋巴细胞亚群及活化的正常参考范围。
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健龄宝对免疫力低下小鼠免疫功能的影响
q=4.77～7.63,P<0.05、0.01).结论 健龄宝可增强环磷酰胺所致免疫力低下小鼠的非特异性免疫、体液免疫、细胞免疫功能,并能纠正T淋巴细胞亚群的紊乱.
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重组人可溶性B淋巴细胞激活因子的制备及活性分析
目的制备具有功能活性的人TNF家族的B细胞激活因子(B cell activating factortothe TNF family,BAFF)胞外区134～285氨基酸残基段,为BAFF的深入研究创造条件.方法提取人新鲜扁桃体组织总RNA,经RT-PCR扩增编码人BAFF胞外区134～285氨基酸残基cDNA,经序列测定后,构建于原核表达载体pQE-80L并转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达及Ni2+-NTA柱层析纯化目的蛋白,行SDS-PAGE和Western印迹检测.后经MTT法检测其增殖活性.结果RT-PCR扩增得到了459 bp的cDNA片段,序列分析与GenBank中报道的编码人BAFF134-285的cDNA序列一致,SDS-PAGE及Western印迹证实表达蛋白确实为6×His-BAFF134-285融合蛋白并存在于包涵体中.活性检测证实其能明显刺激肿瘤细胞的增殖.结论利用大肠杆菌可高效表达rhBAFF134-285,得到的纯化蛋白具有较高的生物学活性,为进一步的研究奠定了基础.
