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乙肝的新治疗疫苗可诱导细胞与体液免疫应答而不具耐受性
慢性乙肝和丙肝的治疗性疫苗正在研究中，作为长期抗病毒治疗或仅仅是部分有效治疗的替代者，它们应能激活患者的免疫系统以与病毒抗争并终控制病毒。治疗性疫苗接种的范例是除了激活体液免疫应答外，还要强效诱导抗病毒关键抗原的T细胞应答。作者评估了由乙肝表面抗原（ HBsAg ）和核心抗原（ HBcAg ）以及皂苷为基础的ISCOMA-TRIXTM 佐剂所组成的新疫苗配方在C57BL／6小鼠中刺激T和B细胞应答的能力和在同源HBV转基因（ HBVtg ）中破坏耐受性的能力。在C57 BL／6小鼠中，根据IFN-γ、TNF-α和IL-2的染色测定疫苗诱导了多功能的HBsAg 与HBcAg 特异性 CD8＋T 细胞，诱导了抗这两种抗原的高滴度抗体。接种HB-sAg的动物在接种后两周诱导了脾内强有力的HB-sAg和HBcAg特异性CD8＋T细胞应答，诱导了肝内HBcAg特异性CD8＋T细胞应答以及抗HBs的血清阳转。此外，接种还减少了HBVta小鼠肝中HBcAg的表达，从而未引起肝的损伤。总之，此研究证明新疫苗配方在免疫耐受、慢性HBV感染小鼠模型中具有治疗效果。
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关注全球生物安全,加快实验动物标准化进程
近20年来世界先后发现了20多种新传染病,如莱姆病、艾滋病、埃伯拉等等,一些已被控制的传染病又重新流行[1].新世纪伊始,疯牛病狂卷欧陆,口蹄疫肆虐全球,禽流感一度困扰香港……,对经济和社会造成重创.近期联合国大会又就目前艾滋病问题专门召开联大会议呼吁"全球关注、全球参与".同时,有关转基因及克隆技术的安全性问题从其诞生第一天起就没有停止过争议.可以说,目前生物科学界面临严峻的生物安全挑战.生命科学领域中的实验动物工作在为人类的健康做出越来越重要的作用的同时,不容置疑地也涉及到一定的生物安全问题,本文试从全球生物安全危机的概况、原因结合实验动物工作中存在的或潜在的生物安全危险进行阐述,通过加快实验动物标准化进程,保证实验动物事业健康发展的同时为维护全球生物安全做出贡献.
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锌指蛋白A20转基因预处理对小鼠内毒素血症肺组织炎症损伤的影响
内毒素性急性肺损伤(acute lunginjury,ALI)是严重创伤或感染后出现早、发病率高的并发症之一.
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转基因修饰的组织工程骨在兔腰椎横突间融合中的应用
目的 探讨以携带有人骨形态发生蛋白(BMP)-2基因片段的复制缺陷重组腺病毒(Ad-BMP-2)转基因修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)作为种子细胞,以脱细胞脱钙骨基质材料为支架构建组织工程人工骨用于兔腰椎横突间融合的可行性. 方法 选择18只日本大耳白兔,在L5,6行单节段双侧横突间融合术,依植入融合材料分为3组:A组为转基因修饰的组织工程骨组;B组为自体髂骨组;C组为单纯支架组.每组12侧.术后12周取出融合节段脊柱,通过大体观察、组织学、影像学及生物力学等方法检测脊柱融合情况. 结果 三组横突间融合成功率分别为84%(10/12)、75%(9/12)和8%(1/12);组织学、影像学及生物力学检测证实,A、B组成骨活跃,脊柱融合的硬度和强度显著高于C组. 结论 转基因修饰的组织工程骨用于脊柱融合可以达到很好的治疗效果.
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地塞米松预培养兔BMSCs促进腺病毒介导BMP2转基因的高效表达
目前,骨形态发生蛋白2(BMP2)的基因治疗在骨组织工程中正成为广泛研究的热点.国外新研究表明,以腺病毒为载体转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)表达BMP2的效率取决于细胞的分化状态,1 μmol/L地塞米松诱导培养人BMSCs后再进行腺病毒转染,其BMP2的表达量是单纯转染组的20倍[1]..
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脑源性神经营养因子转基因细胞移植和甲基强的松龙对损伤脊髓caspase-3表达的影响
目的探讨大鼠脊髓损伤后腺病毒介导的脑源性神经营养因子(AxCA-BDNF)体外转基因成肌细胞移植和静脉内注射大剂量甲基强的松龙(MP)对大鼠脊髓细胞caspase-3表达的影响. 方法将120只大鼠分为脊髓挫伤组(A组)、脊髓挫伤后AxCA-BDNF基因转染的成肌细胞移植组 (B组)、脊髓挫伤后静脉内注射大剂量甲基强的松龙治疗组(C组)、AxCA-BDNF基因转染的成肌细胞移植和静脉内注射大剂量甲基强的松龙治疗组(D组).伤后1,3,7,14,28 d,应用免疫组化法对脊髓损伤区进行细胞凋亡caspase-3蛋白表达的测定,并采用计算机图像分析技术进行定量分析.应用行为学和电生理检查方法观察大鼠运动功能恢复情况. 结果 A、B、C、D四组中均发现凋亡caspase-3蛋白阳性表达细胞;各组caspase-3免疫反应阳性细胞数依次为A>B>C>D组(P＜0.05),与大鼠后肢功能恢复有平行的变化趋势. 结论体外转基因成肌细胞移植和大剂量甲基强的松龙能抑制脊髓损伤后的细胞凋亡.
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NgR1复合物的分子基础与干扰策略
中枢神经损伤后再生与修复是困扰神经科学研究者的难题,近年来应用神经营养因子、转基因、细胞移植等手段在神经元保护和促进内在再生能力方面取得了一定的成果.然而,由于髓鞘相关糖蛋白(myelin-associated glycoprotein,MAG)、少突胶质细胞髓鞘糖蛋白(oligodendrocyte-myelin glycoprotein,OMgp)和Nogo-A等多种抑制因子的抑制作用,再生神经纤维不能或很少能穿越胶质瘢痕.研究表明,Nogo-A、MAG和OMgp是通过与Nogo-66受体(NgR1)复合物的结合来发挥作用的[1-3].笔者拟对近年来关于NgR1受体复合物的研究加以综述.
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移植分泌神经营养因子-3的人胚神经干细胞对大鼠脊髓损伤后功能恢复的影响
目的 探索Lentivirus介导神经营养因子(NT-3)转染的人胚神经干细胞(human neural stem cells, hNSCs)对大鼠损伤脊髓治疗机制和治疗的作用机制.方法 在体外用Lentivirus构建同时表达绿色荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)和NT-3的hNSCs,将其移植到T10脊髓半横断损伤的大鼠体内,用荧光显微镜和BBB评分观察体内转基因表达和大鼠功能恢复情况,用免疫组化染色检测移植细胞在体内存活分化情况.结果 (1)在体外用Lentivirus成功构建了同时表达多基因的人胚基因工程NSC并检测到了稳定的转基因表达;(2)用荧光显微镜可以检测到到hNSC,能在体内长时间存活并表达转基因;(3)BBB评分检测到hNSCs移植组大鼠后肢功能有明显恢复;(4)移植的基因工程hNSC能在体内分化为神经元及星形胶质细胞等功能细胞.结论 Lentivirus介导NT-3转染的hNSC能够调整损伤的局部微环境促进损伤脊髓的功能恢复.
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Lentivirus介导神经营养因子-3促进脊髓损伤大鼠功能恢复
目的探讨Lentivirus介导分泌神经营养因子-3(NT-3)直接体内转基因治疗大鼠脊髓损伤作用和机制. 方法将28只Wistar大鼠在T10水平制成半横断损伤模型,随机分为体内转基因治疗组和损伤对照组,每组14只;用携带NT-3和绿色荧光蛋白(GFP)的Lentivirus对大鼠行直接体内转基因治疗;荧光显微镜观察体内转基因表达,后肢运动功能评分法(BBB评分)检测大鼠后肢功能恢复情况. 结果用荧光显微镜检测到损伤脊髓内有较多的持续表达转基因的细胞;BBB评分结果显示,从伤后第4周开始,实验组大鼠后肢功能较对照组明显恢复(P＜0.01),至第10周时,实验组和对照组BBB分差增大,达3.3分. 结论 Lentivirus是一种有效的转基因载体,由Lentivirus介导分泌NT-3的直接体内转基因治疗能够明显促进损伤脊髓的功能恢复.
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体外诱导负载TGF-β1基因的兔关节滑膜细胞向软骨细胞分化
目的 探讨体外诱导负载TGF-β1基因的兔关节滑膜细胞向透明软骨细胞分化的可行性,为组织工程学修复关节软骨损伤提供体外实验依据.方法 体外培养扩增B型滑膜细胞并纯化,构建pcDNA3.1-TGF-β1,用Lipofectamine 2000法转染,转染pcDNA3.1-TGF-β1组为实验组,转染pcDNA3.1(+)空质粒组为对照组,未转染组为空白组.转染后48 h行G418筛选,RT-PCR检测TGF-β1的瞬时表达,同时取阳性细胞爬片,行抗TGF-β1免疫组织化学染色;G418维持筛选,每2 d取部分细胞计数,连续12 d,绘制生长曲线,转染后3周,每周取部分细胞爬片行抗TGF-β1和抗Ⅱ型胶原免疫组织化学染色.图像分析采用Image-Pro Plus V6.0软件分析处理,实验数据采用SPSS 13.0行统计学处理,组间两两比较采用方差分析.结果 实验组转染后转染率为18%,转染后生长曲线显示细胞早期生长活性下降,细胞数量在转染后第4天降低到3.6×104/ml,第3天RT-PCR检测到TGF-β1阳性片段,抗TGF-β1免疫组织化学染色见细胞内阳性颗粒,对照组及空白组均为阴性;细胞转染后第3周,实验组抗TGF-β1及抗Ⅱ型胶原免疫组织化学染色仍见细胞内阳性颗粒,对照组及空白组为阴性;图像分析结果表明,转染后第7天实验组抗TGF-β1的PU值为(19.04±1.26),对照组及空白组PU值分别为(4.07±0.65)和(3.23±0.56),差异有统计学意义(P<0.05);转染后14 d实验组抗Ⅱ型胶原的PU值为(13.74±1.27),对照组及空白组PU值分别为(4.62±0.56)和(3.93±0.38),差异有统计学意义(P<0.05).结论 脂质体法重组pcDNA3.1-TGF-β1基因可成功转染兔关节滑膜细胞,转染后细胞成功表达TGF-β1,并分泌Ⅱ型胶原蛋白,表现出透明软骨细胞样生理特征,滑膜细胞有望成为一种良好的软骨组织工程的种子细胞.
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PLGA引导转NT-3基因小胶质细胞对损伤脊髓功能恢复的影响
目的 研究乙交酯-丙交酯共聚物(PLGA)引导转神经营养素-3(NT-3)基因的小胶质细胞对神经轴突再生的影响,观察神经环路重建后神经功能的恢复情况.方法 选取成年雌性Wistar大鼠60只,制备中度脊髓损伤动物模型.建模成功后,将其随机分为空白对照组、PLGA移植组、细胞移植组和联合移植组,每组15只大鼠.并分别向各组大鼠脊髓损伤部位注入生理盐水、PLGA、活化的转NT-3基因小胶质细胞以及活化的转NT-3基因小胶质细胞与PLGA的复合体均5μL.在移植后第1、2、4、6周,根据大鼠恢复情况进行相应运动功能评分(BBB评分).建模7周后,处死大鼠,每组随机选出5只大鼠取损伤区域脊髓行常规苏木精-伊红染色,光镜下比较损伤脊髓的形态学变化.结果 各实验组BBB评分随着时间延长均有所升高,但联合移植组第2、4、6周后肢运动BBB评分较其他各组明显升高(F时间=1 869.848,F组,别=1 000.339,F时间×组别=92.161,P＜0.01),并且在6周后可见有前后肢体协调活动.镜下观察显示,联合移植组大鼠损伤脊髓的液化坏死区域面积较其他各组小,修复区内可见大量的神经细胞与轴突长入,且分布较均匀,走形更规则.结论 PLGA引导转基因活化小胶质细胞可促进大鼠脊髓损伤后轴突再生和后肢运动功能的恢复.
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fat-1转基因对小鼠饮食诱导肥胖的影响
目的 研究fat-1转基因对小鼠饮食诱导肥胖的抑制作用及其机制.方法 将小鼠分为高脂饮食fat-1转基因和非转基因组及正常饮食fat 1转基因和非转基因组4组.每周记录小鼠体质量和体长,实验结束时称量小鼠内脏周围脂肪质量,测定血清中血脂含量和胃组织内nesfatin-1、ghrelin mRNA的相对表达量.结果 转基因小鼠的内脏周围脂肪质量均低于非转基因小鼠(F=20.56～41.75,P＜0.01).转基因小鼠空腹血糖(FBG)及血清三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平均低于非转基因小鼠(F=15.59～94.07,P＜0.01).转基因小鼠胃组织中nesfatin-1的表达降低(F=18.50,P＜0.01),ghre-lin的表达升高(F=14.09,P＜0.01).nesfatin-1表达与Lee ' s指数呈正相关(r=0.621,P＜0.01),ghrelin表达与Lee's指数呈负相关(r=-0.603,P＜0.01).结论 fat-1转基因小鼠通过增加内源性n-3多不饱和脂肪酸降低体内n-6/n-3比值,从而调节血脂及肥胖因子的表达,改善机体能量代谢,抑制肥胖的发生.
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EB病毒早期基因BHRF1转基因小鼠纯合子建立及建系
目的 构建整合有EB病毒(EBV)早期基因BamHI-H右向读码框1(BHRF1)基因纯合子转基因小鼠.方法 通过显微注射技术构建BHRF1阳性首建鼠F0共16只,将转基因小鼠与正常小鼠交配,得到子代F1小鼠,PCR技术检测子鼠鼠尾组织DNA,鉴定筛选BHRF1阳性鼠.阳性鼠再与同系阴性鼠杂交得到F2小鼠,筛选出F2小鼠中的阳性鼠近交得F3小鼠.筛选出F3小鼠中的纯阳性鼠进行近交,得到纯阳性F4小鼠.F4小鼠再近交得到纯阳性F5小鼠.结果 经PCR及测序证实,F4、F5小鼠均为BHRF1阳性鼠,测序结果经blast比对,与BHRF1基因完全相同.结论 本实验首次建立了BHRF1转基因鼠模型,并成功筛选出纯阳性BHRF1转基因小鼠,为深入研究BHRF1的生物学特性及其在EBV相关肿瘤发生发展中的作用提供了理想的动物模型.
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EB病毒早期基因BHRF1转基因模型鼠的建立
目的 构建稳定表达EB病毒早期基因BHRF1蛋白的重组载体,通过显微注射法建立BHRF1转基因鼠模型.方法 自EBV阳性细胞系B95-8提取总RNA,应用RT-PCR扩增BHRFI基因,然后与pcDNA3.1(+)连接,构建pcDNA3,1-BHRF1重组载体.重组载体用Nru Ⅰ和Dra Ⅲ双酶切,电泳后纯化回收长约2 000 bp的目的 片段溶于显微注射缓冲液.从超排小鼠取健康受精卵.通过显微注射技术,将纯化的CMV+BHRF1+potyA DNA片段注射入小鼠受精卵,短暂培养后选择健康受精卵移人假孕母鼠输卵管内.采用PCR检测子鼠鼠尾组织DNA,鉴定筛选BHRF1阳性首建鼠.结果 经PCR、限制性内切酶鉴定及测序证实pcDNA3.1-BHRF1重组载体构建成功,Dra Ⅲ和Nru Ⅰ双酶切获得长约2 000 bp的CMV+BHRF1+polyA DNA片段.自18只见栓超排小鼠获取健康受精卵480枚.分别注入纯化的目的 片段,经短暂培养后390枚受精卵仍健康,移入14只假孕母鼠输卵管内,11只受孕,产下74只子鼠.PCR检测子鼠鼠尾DNA获得16只阳性首建鼠.阳性率为21.6%(16/74).结论 本实验首次建立了BHRF1转基因鼠模型.为深入研究BHRFl的生物学特性及其在EBV相关肿瘤发生发展中的作用提供了理想的动物模型.
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fat-1转基因小鼠的构建与鉴定
目的 构建和鉴定携带有外源fat-1基因的转基因小鼠.方法 将fat-1基因的cDNA与动物表达载体pEF-neo连接,构建pEF-fat-1重组质粒, 酶切、测序鉴定正确后,以显微注射法把线性化重组质粒注射到小鼠受精卵的雄原核中,并将受精卵移植到受体鼠的输卵管中产出转基因小鼠,通过PCR、Southern blot杂交等方法确立阳性整合有目的 基因的G0代小鼠.结果 成功构建了pEF-fat-1重组质粒,将其显微注射到小鼠受精卵中,得到G0代小鼠,PCR、Southern blot杂交确立了4只整合有fat-1基因的首建鼠.结论 fat-1基因可整合到小鼠体内,得到的转基因小鼠为研究fat-1基因的生物学功能提供了动物模型.
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利用GalTKO.hCD46转基因猪以及糖蛋白Ib阻断猪-狒狒异种肝移植
研究背景:尽管将转基因猪的肝脏移植入狒狒体内获得了受体长达7天的生存记录,但其存活依然受到血管重建后立即发生极其严重的血小板减少症以及继发的凝血功能障碍的影响.
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我国转基因生物安全立法的现状、问题与对策研究
我国转基因生物安全立法在发展过程中体现了“以外促内”的特点.目前,我国转基因生物安全立法层次太低,管理部门之间条块分割、多头监管的体制使得监管制度覆盖不全面,从而影响了对转基因生物安全进行监管的总体效果.此外,转基因标识制度不健全,公众参与度不高.应当通过集中、综合性立法的方式构建我国转基因生物安全制度的法律体系,建立国家转基因生物安全管理协调机构,完善监管机制,不断提高对转基因生物的监管水平.同时也要完善标识制度和公众参与制度,保障社会公众对转基因生物安全事务的知情权、参与权.
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荧光PCR同时检测转基因成分35S和NOS
根据转基因作物中常用的花椰菜花叶病毒启动子(CaMV 35S)和根癌农杆菌终止子(NOS)基因序列,设计并合成了两对不同的引物和相对应的两种荧光双链探针,建立一种应用荧光双链探针的实时PCR定量检测转基因成分35S启动子和NOS终止子的方法.并利用该方法对马铃薯、大豆、玉米、甜椒、番茄等实物样品进行了检测,发现11份样品中有5份检出35S和NOS基因成分,其余6份样品结果为阴性.结果表明本文建立的荧光PCR方法能有效检测出35S和NOS两种转基因成分,较常规PCR技术更为简便、快速、准确,有很好的应用前景和研究价值.
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3种花卉基固组DNA的提取及转基因成分的PCR检测
采用CTAB微量法和试剂盒提取菊花、矮牵牛、非洲菊3种花卉的基因组DNA,试剂盒提取的效果较好.设计合成了3对引物,分别扩增花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus,CaMV)35S启动子、根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因终止子(NOS!)、大肠杆菌K12菌株新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NPTⅡ)基因.PCR检测结果表明,3种花卉中仅矮牵牛的一个样品为阳性,含有这3种转基因成分,酶切鉴定结果验证了PCR产物为非假阳性.
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美国大部分种植者对Bt基因玉米反应谨慎
根据美国国家玉米种植者协会(NCGA)的调查,大部分转基因玉米种植者一直表明,他们正在通过实施Bt作物良好规范,对环境承担负责任的管理.大部分农场主正在执行将有助于避免昆虫对Bt玉米产生潜在抗性的管理规范.2002年1月31日,在2001年收获季节进行的调查结果已被递交给美国环境保护署(US EPA).
