抗乙肝药物ZY101对HBV转基因鼠体内抗病毒作用研究

目的:观察ZY101在HBV转基因BALB/c小鼠体内的抗HBV作用.方法:将30只雄性HBV转基因鼠随机分为阴性对照组(杜氏磷酸盐缓冲液,DPBS)、阳性对照组(每天一次灌胃给予拉米夫定150 mg·kg-1)、ZY101低剂量组(1 mg·kg-1)、ZY101中剂量组(3 mg·k-1)和ZY101高剂量组(10 mg·kg-1),每组6只,阳性对照组每天一次灌胃给药,其他组单次尾静脉注射.药前、药后后1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38 w采集血清,用ELISA试剂盒检测HBsAg、HBeAg的表达,用实时荧光定量PCR技术检测血清中HBV DNA的含量.药后38 w处死所有动物,采集肝组织,检测肝组织中HBsAg和HBeAg表达及HBV DNA和RNA的含量.结果:拉米夫定每天灌胃给予HBV转基因小鼠150 mg·kg-1能够明显降低血清HBV DNA水平(P＜0.05),但对HBsAg、HBeAg和HBV RNA无明显影响;ZY101分别单次尾静脉注射给予HBV转基因小鼠1、3、10 mg·kg-1,能够降低血清及肝组织中HBsAg和HBeAg的水平(P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01),且有剂量依赖性,但血清HBV DNA及肝组织HBV DNA、HBV RNA水平无显著影响.结论:在本实验条件下,拉米夫定每天灌胃给予HBV转基因小鼠150mg· kg-1能够降低血清HBV DNA水平;ZY101单次尾静脉注射给予HBV转基因小鼠1、3、10mg·kg-,能够剂量依赖的降低HBsAg和HBeAg的表达水平.

转基因的完全沉默可能与逆转录病毒载体重组有关

转基因沉默是转基因基础研究和临床基因治疗应用研究中的两大障碍之一,本文以转导单拷贝逆转录病毒载体MGPN2的HT1080细胞克隆为研究模型,利用一系列分子生物学技术探索转基因沉默的机制,为构建高效表达转基因的载体提供帮助.结果显示:在无GFP蛋白生成的115号细胞克隆中,载体的表观遗传修饰与其它克隆比没有明显变化,载体启动子能有效启动报告基因GFP的转录,但是转录本的大小和序列发生了显著改变,导致转录本阅读框改变.因此,除染色体位置效应引起转基因载体表观遗传修饰改变而导致转基因的沉默以外,逆转录病毒载体转录本阅读框的改变也可以引起转基因的完全沉默,这可能与载体自身重组有关.

大鼠β-防御素-2基因气道转染增强肺抗感染防御功能的研究

β-防御素体外试验显示具广谱抗菌活性,本研究应用转基因方法评估其体内抗菌作用.构建大鼠β-防御素-2(rBD2)重组质粒pBK-CMV-rBD2和pCDNA-3.1-Myc-His(+)-rBD2,通过脂质体包裹的方法将重组质粒经气管滴入,检测其在气管和肺组织表达情况,并应用肺组织匀浆上清菌落计数法检察对绿脓杆菌的肺清除率.结果显示在基因转染大鼠的气管和肺组织内均检测到rBD2-His融合蛋白基因mRNA和蛋白的表达,说明脂质体包裹的重组β-防御素-2pBK-CMV-rBD2质粒可有效转染气道上皮组织.肺细菌清除率实验显示构建重组质粒pBK-CMV-rBD2气道转染与对照相比可显著提高肺组织对绿脓杆菌的清除率(n(8,p(0.01).本研究表明β-防御素基因气道转染可提高呼吸道天然抗感染防御功能,可能在呼吸道感染的防治实践中具有潜在应用价值.

条件化转染MT基因小鼠模型的建立

目的建立四环素诱导调控的MT转基因小鼠模型,为血管瘤试验研究及MT致瘤机理研究奠定基础.方法通过PCR方法从鸡的基因组序列中克隆绝缘子元件;构建四环素诱导调控的条件化转基因质粒,并将其调控元件和受控元件串联成一个载体,在两元件之间插入绝缘子,以减轻两者之间的相互干扰.为提高转基因的表达效率,在转基因盒的上游亦插入绝缘子元件;将MT基因亚克隆至此载体;转基因载体功能行细胞瞬转试验及半定量逆转录-PCR验证后,将其在体外扩增、酶切、回收,行小鼠受精卵原核注射,获得转染MT基因阳性小鼠;强力霉素体外诱导部分阳性鼠MT基因表达,使其具有血管瘤表型.结果绝缘子元件成功克隆;成功构建条件化转基因载体;体外试验证实目的基因的表达受强力霉素的严格调控;通过原核注射,获得5只转基因阳性鼠;2只行体外诱导2月后,1只出现血管瘤表型,逆转录-PCR检测证实MT表达.其余3只阳性小鼠在传代建系中.结论条件化MT转基因小鼠模型成功构建,此小鼠模型能够为血管瘤的试验研究及MT致瘤机理的体内研究提供一定的基础.

慢性髓系白血病动物模型的研究现状

慢性髓系白血病(CML)的发生发展是机体内正常信号传导网络失衡的结果,它涉及到多个可能的传导通路,借助动物模型来深入阐述CML发生及急变的分子生物学机制是终治愈CML的突破口.目前建立CML动物模型主要有三种方法,包括转基因法,将bcr-abl阳性细胞移植给同基因小鼠或免疫缺陷小鼠及逆转录病毒载体法.

异种移植中转基因动物的应用研究进展

随着器官移植领域基础研究的逐步深入和临床技术的日益完善,器官移植术已经成为治疗器官功能衰竭等疾病的首选方法.然而,器官移植在世界范围内面临着严重的供者器官来源短缺问题,临床器官移植技术的应用因此受到极大制约.为有效缓解器官供需间日益突出的矛盾,异种器官移植作为解决供者器官不足的重要战略之一,近年来再次得到广泛关注和深入研究[1].相对于同种异基因移植而言,异种移植在因免疫学不相容所导致的体液及细胞排斥反应方面更为复杂和难以克服.同时,由于生物进化过程中在生理和代谢等方面形成的差异,也成为阻碍异种移植应用研究重要的天然障碍.然而,基因工程技术的发展给异种移植研究带来了根本性的推动作用.通过基因敲除等基因修饰方法及建立转基因动物,让异种供者器官细胞上表达新的分子或阻止特定分子表达,使异种移植研究能够更加接近于临床实践.由于猪在来源、致病因素、以及生理特性与人类存在相似性等诸多方面存在优势,目前认为猪是异种器官的理想供源.因而,建立不同类型转基因猪,并相应作为大动物模型进行猪-灵长类动物间异种移植免疫排斥反应机理研究,已成为当前异种移植研究领域的热点.

血吸虫抗原诱导抗肿瘤免疫的实验研究

肿瘤的免疫治疗是当今医学科学研究领域中的前沿课题[1,2].近年来,利用转细胞因子方法治疗肿瘤已在动物肿瘤模型和某些人体肿瘤中应用[3],获得较好的效果.但是,将细胞因子的基因注入肿瘤细胞的过程复杂且耗费大,同时又必须针对患者个体的肿瘤进行基因转移,不利于推广,故选择一种简便经济的方法取代转基因过程,又能达到诱导肿瘤局部产生大量抗肿瘤的细胞因子的目的.目前国内外已有这方面的探索性研究[4],即运用其它非特异性抗原(如病毒、某些寄生虫多肽)诱导抗肿瘤免疫.

应用内皮型一氧化氮合酶基因转染冠状动脉旁路移植血管桥的研究进展

冠状动脉旁路移植术后血管桥再狭窄一直困扰着冠状动脉外科的发展,许多研究表明血管桥再狭窄的发生与一氧化氮的功能异常相关,用转基因方法转移重组内皮型一氧化氮合酶基因,重建内源性一氧化氮功能,是冠状动脉旁路移植术后血管桥再狭窄治疗的新策略,本文就血管桥转基因一氧化氮合酶同工酶的选择、靶细胞的选择、转基因载体、就转基因的检测及应用等国内外研究进展作一综述.

骨形成蛋白2基因修饰的骨髓基质细胞与纤维蛋白复合物修复兔关节软骨缺损

目的研究骨形成蛋白2(bone mophogenetic protein 2, BMP-2)重组腺病毒(adenovirus)转染骨髓基质细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)后,与纤维蛋白凝胶构成的复合物(Ad-BMP-2+MSCs-纤维蛋白凝胶)对兔关节软骨缺损修复的影响. 方法①Ad-BMP-2转染原代培养的MSCs,通过RT-PCR、细胞免疫组织化学染色、甲苯胺蓝染色等观察转染后3～9 d的MSCs其BMP-2、Ⅱ型胶原及蛋白多糖转录、表达水平的变化.②转染后的MSCs种植于纤维蛋白凝胶,在体外培养1～9 d,通过上述指标及透射电镜观察三维培养条件下其软骨基质的产生.③42只日本大耳白兔先制成直径4.5 mm全层软骨缺损模型,随机分为3组(n=14):A组为Ad-BMP-2+MSCs-纤维蛋白凝胶修复组,B组为MSCs-纤维蛋白凝胶修复组,C组为空白对照组.术后4、8和12周取材行大体观察、HE染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学及12周关节软骨弹性常数检测. 结果①Ad-BMP-2转基因MSCs的BMP-2、Ⅱ型胶原 mRNA RT-PCR检测分别在3、5 d呈阳性,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05).②转基因MSCs三维培养物免疫组织化学和甲苯胺蓝染色呈阳性,电镜显示细胞生长良好,有基质合成.③A组各时间点大体、组织形态学和组织化学染色均显著优于B组和C组,12周时力学和组织学已接近正常关节软骨. 结论 Ad-BMP-2能通过促进MSCs分泌BMP-2,诱导Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达,在纤维蛋白三维支架中形成软骨基质,移植入兔关节软骨缺损区可修复直径4.5 mm缺损,其修复组织成分接近正常软骨.

外源MDR-1基因对小鼠肺腺癌细胞耐药性产生的影响及机理研究

目的了解MDR-1基因表达与肺癌细胞耐药性的关系.方法用FUGENTM6转染试剂将MDR-1基因导入小鼠Lewis肺腺癌细胞株(3LL),建立了耐药细胞株(3LL-MDR-1).用MTT方法测定细胞耐药性并观察异搏定对耐药的逆转效应,MDR-1基因表达产物P-gp采用免疫组化方法观察,应用流式细胞仪分析其对示踪剂罗丹明123的摄取与排泄.结果建立了一株能稳定表达P-gp和对长春生物碱类、鬼臼毒素类具有显著耐药性的细胞株.免疫组化证实耐药细胞高度表达P-gp糖蛋白.异搏定能部分逆转该细胞株的耐药性,且效应随着剂量递增,流式细胞仪测定显示耐药细胞对示踪剂的排泄作用显著高于亲代细胞.结论通过基因转染实验,证明MDR-1基因表达与肺癌细胞多药耐药有关.

制瘤素通过其受体gp130/OSMRβ诱发转基因鼠视网膜变性

目的研究晶状体特异性表达的制瘤素(OSM)诱发视网膜变性的信号途径.方法将去除部分序列的小鼠OSM cDNA(661碱基对)连接到αA-晶状体蛋白(αA-crystallin)启动子上,然后用显微注射的方法将其导入单细胞胚胎内,建立OSM转基因鼠.采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测非转基因鼠和OSM转基因鼠视网膜中OSM受体gp130/OSMRβ mRNA的表达,兔抗磷酸化的转录信号传递和激活因子-3(STAT-3)抗体检测磷酸化的STAT-3蛋白质的表达,鼠抗细胞色素C抗体检测视网膜中细胞色素C的分布.结果在新生的非转基因鼠视网膜中有gp130/OSMRβ mRNA的表达.胚胎期17.5d,OSM转基因鼠视网膜细胞核中有大量的磷酸化的STAT-3的积聚.出生后1 d,OSM转基因鼠视网膜中有大量细胞色素C分布. 结论晶状体特异性表达的OSM可能作用于视网膜中gp130/OSMRβ受体,激活STAT-3,引起细胞色素C从线粒体中大量释放,诱发广泛的视网膜变性.

视网膜特异性表达人血管内皮生长因子基因载体的构建

目的构建在视网膜组织特异性表达的人血管内皮生长因子(VEGF)165基因. 方法用聚合酶链反应(PCR)方法从BLAB/C鼠全基因组扩增能在视网膜组织特异性表达的rho启动子,经限制性内切酶纯化后克隆于质粒pcDNA3.1+-VEGF165中,建立重组质粒pcDNA3.1+-rho-VEGF165,通过限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确重组质粒pcDNA3.1+-rho-VEGF165,由jetPEI介导转染人视网膜色素上皮细胞和人脐静脉内皮细胞,并通过免疫组织化学染色以及绘制细胞生长曲线检测在人视网膜色素上皮细胞和人脐静脉内皮细胞中VEGF蛋白的表达. 结果在人视网膜色素上皮细胞中,重组质粒pcDNA3.1+-rho-VEGF165比质粒pcDNA3.1+-VEGF165的VEGF蛋白表达强,在人脐静脉内皮细胞,两者的表达量无明显差别. 结论载体pcDNA3.1+-rho-VEGF165的构建为进一步研究VEGF在视网膜新生血管形成中的致病机理提供基础材料,并为进一步建立视网膜特异性表达VEGF转基因鼠模型建立了基础.

转基因鼠晶状体特异性表达的制瘤素对眼发育的影响

目的研究晶状体特异性表达的制瘤素(oncostatin M,OSM)对眼发育的影响.方法将去除部分序列的小鼠OSM cDNA[661碱基对(base pair,bp)]连接到αA-晶状体蛋白(αA-crystallin)启动子上,然后用显微注射的方法将其导入单细胞胚胎内,建立转基因鼠.常规组织学及免疫组织化学方法对转基因鼠进行特性鉴定,末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿嘧啶末端标记(terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP nick-end labelling,TUNEL)试验检测细胞凋亡,原位杂交检测caspase-3mRNA的表达,兔抗活化的caspase-3抗体检测活化的caspase-3蛋白质.结果胚胎期14.5、17.5 d,转基因蛋白OSM特异性表达于晶状体纤维细胞内,从胚胎期17.5 d开始,转基因鼠视网膜开始发生变性,出生时,50%以上的视网膜细胞丢失.TUNEL试验显示转基因鼠视网膜细胞凋亡.转基因鼠视网膜细胞中caspase-3被激活.结论晶状体特异性的OSM表达激活caspase-3,导致了眼的异常发育、细胞凋亡及广泛的视网膜变性.

合格伦综合征基因工程动物模型的研究

本文围绕两大类基因工程动物模型即转基因动物模型和基因敲除动物模型，对近年来有关舍格伦综合征基因工程动物模型的研究进展作一综述。

破骨细胞转基因永生化研究进展

细胞永生化是细胞获得持续生长增殖能力的特性。转基因永生化中常用基因有SV40、bcl-2以及Notch基因、端粒酶相关基因、视网膜母细胞瘤基因；基因转移载体有病毒和非病毒载体。通过各种方法转染SV40 Tag和bcl-2等多种基因使破骨细胞或其前体细胞永生化，可较好地解决破骨细胞传统培养方法的局限性，具有很大的应用前景。

030.利用转基因植物制备S-IgA

唾液腺腺病毒载体转基因研究进展

唾液腺转基因治疗具有创伤小、效率高的特点。腺病毒载体是目前唾液腺转基因研究比较常用的栽体之一。本文拟就唾液腺腺病毒载体转基因的应用、转染特点及存在问题作一综述。

脂质体介导hES基因转染人舌鳞癌Tca8113细胞及其蛋白表达

目的建立转人内皮抑素(hES)基因舌鳞癌Tca8113细胞,检测体外培养的转基因细胞基因蛋白表达.方法为了建立携带hES基因的舌鳞癌Tca8113细胞克隆,选用阳离子脂质体Lipofectamin为载体,将含hES基因的质粒--p+{BLAST}-hES转染Tca8113细胞,以Blasticidin S抗生素筛选阳性克隆.免疫组织化学S-P方法检测体外培养的转基因Tca8113细胞克隆中ES的表达.结果经Blasticidin S抗生素筛选,转染hES基因的Tca8113细胞由于具有bsr抗性基因,可以在含有50 μg/ml Blasticidin S的培养基中生长和传代,从而得到携带hES基因的Tca8113细胞克隆.该细胞在体外培养传代96 h后,经免疫组织化学检测,hES表达的强阳性(+ + +)率为100%.结论以脂质体介导hES基因转染Tca8113细胞效率高,转基因细胞具有高效表达活性目的基因产物的能力.

绿色荧光蛋白转基因鼠咀嚼肌肌卫星细胞的分离、体外培养、鉴定及生物学特性的研究

目的 探讨绿色荧光蛋白(GFP)转基因鼠咀嚼肌肌卫星细胞体外培养及传代对咀嚼肌肌卫星细胞GFP荧光保持的影响,从而探讨GFP转基因鼠咀嚼肌肌卫星细胞移植入野生型小鼠后是否可以作为追踪细胞转归的有效方法.方法 取新生GFP转基因鼠面部咀嚼肌,分离出肌卫星细胞,体外进行原代和传代培养,建立GFP转基因小鼠肌卫星细胞系.通过倒置显微镜观察肌卫星细胞的形态、测定生长曲线等方法观察肌卫星细胞的增殖与分化能力;荧光显微镜观察GFP荧光的保持及表达;免疫细胞化学法对所获得的细胞进行骨骼肌肌动蛋白及结蛋白鉴定;DAPI进行细胞核的标记,检测培养细胞的纯度.结果 体外培养的咀嚼肌肌卫星细胞增殖速度快,荧光显微镜观察发现肌卫星细胞经传代后仍然保持其特有的GFP荧光表达.骨骼肌肌动蛋白单抗及抗结蛋白免疫细胞化学染色显示体外培养的咀嚼肌肌卫星细胞呈阳性表达.DAPI免疫细胞化学染色显示经分离及培养后肌卫星细胞纯度较高.结论 体外培养的GFP转基因鼠咀嚼肌肌卫星细胞有很强的增殖分化能力及良好的GFP荧光表达,能够作为追踪细胞来源及归宿的示踪细胞.

常用阿尔茨海默病动物模型制备方法及评价

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)又称老年性痴呆,是一种与年龄相关的中枢神经系统退行性病变.由于其病因不明、发病机制复杂,在研究中缺乏统一、经典的疾病动物模型.本文就目前常用的AD动物模型进行综述,并根据其优缺点进行评价,以供研究者在选择合适的拟AD动物模型时参考.