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锌指并列基因1过表达对高脂诱导脂肪肝炎症的影响
目的 探讨锌指并列基因1 (JAZFl)过表达对高脂诱导小鼠脂肪肝肝脏促炎因子的影响及其机制. 方法 20只雄性3周C57BL/6J-小鼠及10只转基因过表达(JAZF1-Tg)小鼠分为3组:普通食物喂养野生小鼠组(NF组,n=10);高脂食物喂养野生小鼠组(HF组,n=10);高脂食物喂养转基因小鼠组(HJ组,n=10);各组小鼠均喂养12周.定期检测摄食与体质量,12周后,留取各组小鼠血浆与肝脏组织,测定空腹血糖(FBG)、血胰岛素(INS)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、游离脂肪酸(FFA)及丙氨酸氨基转移酶(ALT);用酶法检测肝脏组织甘油三酯含量;用RT-PCR检测小鼠肝脏组织促炎因子肿瘤坏死因子α(TNF α)、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)、白细胞介素8 (IL-8)的mRNA表达水平;利用Western blot方法检测肝组织磷酸化-c-Jun氨基末端激酶/c-Jun氨基末端激酶(P-JNK/JNK)、磷酸化-丝裂原活化蛋白激酶p38/丝裂原活化蛋白激酶p38 (P-P38 MAPK/P 38 MAPK)、磷酸化-细胞外信号调节激酶/细胞外信号调节激酶(P-ERK/ERK)、人核因子κB抑制蛋白α(IKBα)及内参照β-肌动蛋白的蛋白表达水平.对数据的比较,组间采用方差分析、t检验和x2检验.结果 (1) HJ组与HF组相比较,体质量、FBG、INS、TC及ALT均明显下降(依次分别为31.19±0.81比36.07±1.43、6.94±0.32比8.14±0.36、31.09±2.12比45.21±3.34、3.05±0.07比3.81±0.08、54.75±4.92比68.09±5.15,P值均＜0.05),TG、FFA差异无统计学意义(0.72±0.05比0.81±0.03、0.81±0.4比0.87±0.03,P值均＞0.05).(2) HJ组与HF组相比肝脏TG含量差异无统计学意义(35.49±3.17比38.26±3.59,P＞0.05).(3)与HF组相比,HJ组小鼠肝脏组织TNF α,MCP-1及IL-8 mRNA的表达降低,且差异有统计学意义(2.54±0.36比8.64±0.73、1.19±0.12比3.93±0.18、5.09±0.48比9.09±0.89,P值均＜0.01),P-JNK及P-P38MAPK的磷酸化水平低于HF组(0.92±0.06比1.51±0.01、1.07±0.04比1.45±0.04,P值均＜0.01),而IKB α蛋白表达高于HF组(0.99±0.06比0.79±0.05,P＜0.01);然而,HJ组与HF组小鼠肝脏组织P-ERK的蛋白磷酸化水平差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 JAZF1基因表达上调能够抑制高脂喂养小鼠肝脏组织炎症因子TNFα、MCP-1及IL-8的表达,其调控机制可能与JNK、P 38MAPK及NF-κB信号通路的激活抑制密切相关.
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HCV 5′NCR调控抑制活性的反义寡核苷酸的筛选
目的：寻找高效特异的新型抗HCV药物, 探讨针对HCV基因的硫代修饰反义寡核甘酸（S-ASODNs）佳作用靶序列。 方法：参考HCV 5′NCR计算机预测的二级结构图，设计合成了15条S-ASODN、3条正义寡核苷酸及1条随机序列，采用HCV 5′NCR调控荧光素酶基因的瞬时表达系统，将S-ASODN与pHCV-neo4共转染，通过荧光素酶活性表达高低，反映S-ASODN对HCV调控基因的抑制活性。结果：5条S-ASODN即HCV65、HCV279、HCV363、HCV349及HCV352在25～100nmol/L浓度范围内，对HCV调控基因具有特异性的剂量依赖性抑制活性。当浓度为100nmol/L时，这些ASODN的抑制率可达80％以上，IC50值提示HCV363的抑制活性强。通过阴性对照实验包括正义寡核苷酸、随机序列及不含HCV序列的靶载体pGL3提示ASODN仅存在轻度非特异性作用。此外，实验结果还提示不同作用靶位的ASODN之间具有一定的协同作用。 结论：HCV 5′NCR第二茎环结构Ⅱa、第三茎环结构Ⅲd和翻译起始区可能是ASODN作用的重要靶序列。
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转4-1BBL基因细胞诱导带瘤宿主抗瘤效应的体内研究
目的观察协同刺激分子4-1BB L1gand(4-1BBL)基因导入小鼠肝癌细胞Hepal-6后在小鼠体内诱导的抗瘤效应.方法应用逆转录病毒载体,将小鼠4-1BBL导入小鼠肝癌细胞Hepal-6细胞中,Histidirol(HisD)筛选后获高表达4-lBBL分子阳性细胞克隆,经丝裂霉素C(MMC)处理制备成肿瘤细胞瘤苗TCV4-lBBL,观察其对不同动物模型的体内免疫保护作用和免疫治疗作用.结果(1)能对同系肝癌细胞产生完全的免疫保护作用,并能保持无瘤状态长期存活(100d以上).(2)对早期(接种7 d)形成的肿瘤有强的治疗作用.(3)对晚期(接种14d)肿瘤,有明显的治疗作用,使大部分小鼠的肿瘤消退.结论4-1BBL修饰的肿瘤细胞疫苗能明显刺激增强带瘤宿主的抗瘤效应.
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心肌肥厚动物模型建立方法研究进展
目的：综述心肌肥厚（CH）动物模型的建立方法，为CH类疾病的研究和临床治疗提供参考。方法：以“心肌肥厚”“动物模型”“Cardiac hypertrophy”“Model”等组合作为关键词，在中国知网、PubMed等数据库中检索相关文献，筛选2004－2014年有关CH动物模型建立方法的内容，综述常用模型的基本原理、制备方法及特点等。结果与结论：共查阅到376条文献，其中有效文献29条。目前常用的CH动物模型建立方法有物理法（包括压力超负荷法致CH、容量负荷法致CH、心肌梗死致CH、运动诱导致CH）、化学法（包括药物诱导法致CH）和生物法（包括转基因型CH、自发性高血压大鼠模型致CH）等。其均可模拟CH，而CH原理、制备方法和模型特点各异。在CH动物模型中，大鼠易饲养、经济、抗感染力强，常作为首选造模动物，常用鼠种为SD大鼠及小鼠，雌雄均可。在现有成模方法中，压力超负荷法制作慢性CH模型，手术操作简单方便、重复性好、造价低廉，为常用；转基因动物模型对人类疾病的模拟程度更高，但耗时长，费用昂贵，可能成为未来的发展方向。
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锌指蛋白A20突变体转基因小鼠脓毒症肺损伤的研究
目的 了解锌指蛋白A20突变体(A20△)转基因小鼠脓毒症肺损伤的特点,探讨A20△对小鼠脓毒症肺损伤的影响.方法 以A20△转基因脓毒症小鼠为动物模型(A20△转基因组),采用流式细胞仪测定肺组织单核巨噬细胞浸润,ELISA测定肺组织A20△、TNF-α、IL-1β水平,结合肺体指数和病理检查对炎症及其损伤程度进行鉴定.实验同时设LPS对照组(LPS组)和生理盐水对照组(对照组). 结果给予LPS后6、12、24 h,A20△转基因组小鼠肺体指数较LPS组明显下降(P<0.01,P<0.05);A20△转基因组小鼠肺组织浸润单核/巨噬细胞数较LPS组明显下降(P<0.01).给予LPS后3、6 h,A20△转基因组小鼠肺组织炎症细胞因子TNF-α水平较LPS组明显下降(P<0.01);IL-1β水平也较LPS组明显下降(P<0.05,P<0.01);给予LPS后12、24 h,TNF-α和IL-1β水平差异无统计学意义(P>0.05).病理学观察表明A20△转基因组小鼠肺组织充血程度、肺泡积液及肺间质增厚程度均较LPS组轻. 结论 A20△转基因小鼠在一定程度上具有抵御LPS诱导性肺损伤的能力,其机制可能是通过抑制单核细胞向肺组织浸润和降低肺内炎症细胞因子水平实现的.
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锤头状核酶对不同长度mdrl mRNA的体外切割
目的:探讨膀胱癌多药耐药性逆转的新方法.方法:应用计算机对mdrl mRNA二级结构进行模拟,设计针对mdrl mRNA 1959位GUC的"锤头状"(Hammerhead)核酶(Ribozyme 1,RZ1)基因,定点克隆于质粒pGEMEX-1的BamHⅠ和EcoRⅠ位点上;将mdrl cDNA 864 bp的片段亚克隆于pGEMEX-1的HindⅢ和EcoRⅠ位点上,mdrl cDNA 1 383 bp片段亚克隆于pGEMEX-1的EcoRⅠ位点上,在T3启动子作用下体外转录成RZ1、864 nt和1 430 nt的mdrl mRNA.结果:RZ1在体外分别将864 nt和1 430 nt的mdrl mRNA切割成两个片段,切割温度在42°C和52°C两个条件下切割效率差异不明显.结论:核酶对底物的体外切割活性取决于核酶切割位点的选择,与底物长度无关.
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可溶性HLA-G1抑制人自然杀伤细胞NK92 对猪内皮细胞PED的黏附
目的 研究可溶性HLA-G1(HLA-G5)对人自然杀伤细胞(NK细胞)黏附到猪血管内皮细胞(PED)的抑制作用,从而降低人NK细胞对猪血管内皮细胞杀伤杀伤活性.方法 利用核转染技术将pcDNA3-HLA-G5转入LCL721.221细胞株.以RT-PCR、Dot-ELISA技术分别在基因水平和蛋白水平检测HLA-G5的表达;以人类NK细胞系(NK92)效应细胞,猪内皮细胞系(PED)为靶细胞,检测NK92在静止和流动状态下对PED的黏附作用;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测HLA-G5抑制NK细胞的杀伤活性.结果 与未加入HLA-G5的对照组相比,NK92在静止和流动状态下对PED的黏附功能明显降低(P＜0.01),且对HLA-G5组PED的杀伤效率均有明显下降(P＜0.01).结论 HLA-G5可以通过抑制NK92对PED的黏附功能,来减轻NK92对PED的杀伤作用.
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E-cadherin基因转染对膀胱癌细胞生长及浸润能力的影响
目的利用转基因技术,观察E-cadherin(ECD)对膀胱癌生长和浸润转移能力的影响.方法将细胞间粘附分子ECD真核表达载体转染具有高浸润转移能力的膀胱癌细胞系Ts3L,测定细胞的生长曲线、克隆形成能力、体外浸润能力及细胞的周期分布.结果 ECD基因转染后的膀胱癌细胞生长速度明显减慢,达35.7%;凋亡细胞比例明显增加,超高倍体细胞比例明显减少;Ts3L/ECD细胞克隆形成能力显著降低(P<0.01);Ts3L/ECD细胞的浸润能力明显低于其母代及对照细胞.结论 ECD对肿瘤的生长和浸润转移都有显著的抑制作用,是一个重要的肿瘤生长和浸润转移的抑制因子.
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重组白细胞介素10-pEGFP-N2质粒构建及表达
目的 将IL-10基因定向克隆入pEGFP-N2质粒，探讨采用构建的质粒转染支气管上皮细胞H292株，稳定表达IL-10和荧光蛋白可行性。方法 采用定向克隆技术，将IL-10基因克隆入pEGFP-N2质粒，用构建成功的IL-10--pEGFP-N2质粒在Fuge-6介导下转染培养的支气管上皮细胞株(H292),利用免疫组化、RT-PCR检测细胞中IL-10蛋白和mRNA的表达，并在荧光显微镜下观察荧光蛋白表达。结果 ①重组后的pEGFP-N2质粒已成功载入IL-10基因。②IL-10--pEGFP-N2 质粒转染支气管上皮细胞H292株后,可在H292株内表达IL-10mRNA、IL-10蛋白和荧光蛋白。结论 重组的IL-10--pEGFP-N2质粒可在上皮细胞内表达IL-10和荧光蛋白。由于两者共用一个启动子，荧光蛋白表达可报告IL-10表达，适用于动物实验气道内的IL-10转基因研究。
关键词： 白细胞介素10 转基因 支气管上皮细胞株H292 荧光蛋白 -
转基因小鼠模型在特应性皮炎中的应用研究进展
特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)是一种慢性、复发性皮肤炎症性疾病,易反复发作,伴剧烈瘙痒,严重影响了患者的生活质量,近年来发病率呈逐年升高的趋势.该病确切发病机制尚不清楚,可能涉及遗传、免疫、感染等众多因素.转基因小鼠在确定特定基因和蛋白的生理功能及在疾病状态所起的作用方面是非常有价值的工具,近年来AD的转基因小鼠模型有了很大发展,白细胞介素(interleukin,IL)-4转基因小鼠、IL-18转基因小鼠、半胱天冬酶1(caspase-1,CASP1)转基因小鼠、IL-31转基因小鼠、胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin,TSLP)转基因小鼠、RelB缺陷小鼠、组织蛋白酶E(cathepsin E,Cat E)缺乏小鼠、缓激肽释放酶(stratum corneum chymotryptic enzyme,SCCE)转基因小鼠、载脂蛋白C1 (apolipoprotein C1,APOC1)转基因小鼠等从不同的角度显示疾病的特征,对研究疾病的发病机制和开发药物提供了广阔的前景,有助于阐明单个细胞因子和蛋白在AD的发生与发病机制、生物治疗等方面的作用.为此,本文就转基因小鼠模型在AD中的应用研究进展进行简述.
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转基因神经干细胞在脊髓损伤修复中的应用
脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是神经科学领域致死率、致残率高的创伤之一,可直接导致神经元坏死、神经轴突中断、脊髓结构严重破坏.损伤后的微环境又有诸多不利于脊髓神经轴突再生的因素,如多种神经营养因子的缺乏以及胶质疤痕和多种抑制再生的物质存在等.近年来,随着对脊髓损伤机制、病理生理及损伤后局部微环境变化研究的不断深入,已将具有自我更新能力和多元分化潜能的神经干细胞(neural stem cells,NSCs)运用于SCI的实验治疗,并取得良好效果,而转基因NSCs能克服神经营养因子水平低,移植后存活时间短等不足,使得人们对攻克SCI越来越充满信心.现就转基因NSCs应用于SCI修复的研究进展作一综述.
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烧伤创面愈合进展
烧伤创面愈合主要是及早、永久性覆盖创面和防治瘢痕过度增生.创面处理伴随着烧伤的全过程,皮肤移植是覆盖烧伤创面的重要手段.成功的皮肤移植对烧伤感染、休克的预防和创面愈合都至关重要[1].但患者烧伤后,特别是大面积烧伤后自体皮源往往不足,因此,近年来国内外关于各种烧伤创面覆盖自体皮替代物及烧伤异种移植免疫研究进展很快.关于烧伤创面愈合后的瘢痕过度增生的研究热点也转向瘢痕相关基因或致病基因的寻找和对有效药物的筛选.
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肝癌HSV-TK／GCV自杀基因治疗的研究进展
GCV是一种用于抗病毒感染的药物，HSV‐TK基因表达的胸苷激酶能将GCV磷酸化成GCV‐TP取代DNA合成过程中的鸟嘌呤‐5′‐三磷酸，成为DNA合成的竞争性抑制剂，抑制DNA链延长，通过诱导凋亡机制引起细胞死亡［1］。其诱导细胞凋亡的机制还与激活P53通路、线粒体损伤、细胞毒作用等相关。HSV‐TK／GCV系统介导细胞毒作用中存在不可修复的双链DNA断裂，抑制基因的同源修复能够显著增强 HSV‐TK／GCV系统的细胞毒作用［2］。此外让转染了 HSV‐TK 基因的细胞和 TK 基因阴性细胞共培养，给予 GCV 后不仅HSV‐TK基因阳性细胞死亡，TK基因阴性细胞也发生死亡，这种现象为旁观者效应。旁观者效应的产生机制与细胞间存在物质交换相关，其中重要的机制是细胞缝隙连接，一些对细胞缝隙连接形成起促进作用的药物如丹参酮ⅡA等可以使旁观者效应明显增强［3］。 HSV‐TK／GCV 系统通过直接杀细胞作用和旁观者效应显现出良好的抗肿瘤作用，被广泛用于各种肿瘤的治疗研究。
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转基因基质细胞对脐血CD34+细胞体外扩增及早期祖细胞的影响
自1989年Broxmeyer和Geuckman等证实脐血富含造血干/祖细胞,并有可能用于临床造血细胞移植以来,至今在世界范围内已开展了对脐血干/祖细胞及其造血重建、体外扩增的研究,有报道的脐血干/祖细胞移植已达500多例.尽管脐血具有价廉、易获得、富含干/祖细胞等优点,但由于其量的限制而使其应用受限.因此,建立一个理想的脐血干/祖细胞体外扩增体系以保证干细胞存在,同时有大量祖细胞扩增是脐血干/祖细胞移植和以脐血干/祖细胞为靶细胞而进行基因治疗的关键.
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调心方对阿尔茨海默病小鼠模型早期学习记忆能力及LTP的影响
目的 观察调心方对阿尔茨海默病早期APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力及海马长时程增强(LTP)的影响.方法 以3月龄APP/PS1双转基因小鼠30只为动物模型,随机分为模型组、中药组、西药组,各10只.另选取C57野生型小鼠8只作为对照组.采用Morris水迷宫观察小鼠学习记忆能力、电生理记录小鼠海马CA1区LTP变化.结果 与对照组比较,模型组小鼠学习记忆能力明显下降,LTP受抑制,差异均有统计学意义(P<0.05或0.01);与模型组比较,中药组、西药组小鼠学习记忆能力均明显提高,差异均有统计学意义(P<0.05),中药组LTP水平升高,差异有统计学意义(P<0.05或0.01),西药组LTP水平无变化,差异无统计学意义(P>0.05).结论 中药方剂调心方能够改善3月龄APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力及海马区LTP水平,对阿尔茨海默病小鼠模型早期表现学习认知障碍具有改善作用.
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转基因猪对异种移植的影响研究
对于器官衰竭的患者来说，器官移植是好的治疗手段。尽管在过去的50年做了很大的努力，但这个问题仍未完全解决，事实上还有很多新的问题。纵观20世纪，有人尝试用动物器官作为临床移植器官的来源[1-2]。这些动物一般为非人类灵长动物（nonhuman primates，NHPs）。通过一些使用NHPs作为供者的实验发现，移植器官的生存时间都很短，经常只存活几分钟，长也只持续几天。人们开始认识到NHPs不是很适合成为器官及细胞的供者。因此，在20世纪末期，人们开始将注意力转移到猪身上，用猪作为器官及细胞的供者，尽管猪的免疫障碍远远大于NHPs ，但是猪作为供者有很大优势，特别是在目前这个基因时代，转基因猪孕育而生，给猪-人类提供了无限的前景。本文对转基因猪与影响异种移植物存活条件的因素进行综述，为未来的临床异种移植研究提供参考。
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转基因食品产业化的风险防范及制度构建
风险防范机制的缺失是阻碍转基因食品产业发展的因素之一.基于转基因食品产业对人类健康、物种进化和生态环境的负面影响,及时有效地构建风险防范机制十分必要.我国既有的转基因食品产业风险防范机制存在诸多缺陷:未形成转基因食品全程跟踪制度及安全事故应急处理制度,在安全性评价制度及法律责任体系等方面也有待进一步完善.
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从转基因水稻探究科学家社会责任及缺失原因
高速发展的现代科学技术已成为促进经济繁荣,推动社会文明进步的直接动力.然而,科学技术在给人类带来福祉的同时其负面效应亦日益凸显.转基因水稻作为科研的伟大成果,有效地促进了农业发展,具有普通水稻不可逾越的优势,但存在威胁粮食安全、破坏生物多样性的隐患.因此,反思科学技术对人类的双重效应,引导科技朝着造福于人类的方向健康地发展,使科技更好地服务于人类,已成为公众热议的焦点.但是不能简单地将科学技术可能产生的消极影响归咎于技术本身,而应考量掌握科学这把双刃剑的行为主体——科学家,分析其在科学研究及其成果应用中的社会责任,探寻科学家社会责任的缺失原因,以促进科学家履行其社会责任.
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骨骼肌特异表达卵清蛋白(OVA)抗原转基因小鼠构建
目的 利用PiggyBAC转座酶系统及受精卵注射法,将MCK3E-OVA-pA随机插入小鼠基因组,获得骨骼肌特异表达卵清蛋白(OVA)的转基因小鼠(Muscle-OVA Tg).方法 通过体外转录,获得PiggyBAC mRNA;将PiggyBAC mRNA和含有鸡全长OVA片段、骨骼肌肌酸激酶启动子(MCK)、H-2Kb引导序列、H-2Db跨膜序列的质粒显微注射至C57BL/6J小鼠受精卵中,获得转基因阳性首建鼠.将Muscle-OVA Tg鼠与野生B6小鼠杂交建系.PCR鉴定小鼠基因型;Western blot检测小鼠各组织中OVA蛋白表达以验证其组织特异性.结果 PCR检测表明,Muscle-OVA Tg的肌组织表达OVA mRNA;Western blot进一步证实Muscle-OVA Tg小鼠骨骼肌组织特异的OVA蛋白表达,其他组织/器官,如心、脾、肺、肾组织OVA表达均呈阴性.结论 利用PiggyBAC转座酶系统成功构建骨骼肌特异表达鸡OVA抗原的转基因小鼠,为相关的骨骼肌免疫反应研究提供了有价值的动物模型.
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转基因神经干细胞及其移植的研究进展
自从1992年RoybhoIds从成年鼠脑纹状体中首次分离出神经干细胞(neural stem cells NSCs)后,其重要性逐渐被人们认识.神经干细胞为多能干细胞,具有自我更新,分化成为多种类型的神经元和神经胶质细胞的能力.对神经系统的修复,神经干细胞有巨大的治疗前景,其逐步成为近年的研究热点.由于神经干细胞是良好的靶细胞及转基因治疗载体,今年来人们把更多的关注寄希望于神经干细胞转基因后的移植治疗.
