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FGF-23 (R176Q)过表达对成年小鼠磨牙龋损的影响
目的:研究FGF-23 (R176Q)过表达对成年小鼠磨牙龋损的影响及机制.方法:使用CT扫描、血清学检查、HE染色、免疫组化染色和real time RT-PCR等方法检测分析FGF-23 (R176Q)转基因小鼠(TG组,n=20)和野生型小鼠(WT组,n=20)血清钙磷浓度变化和下颌第一磨牙矿化的差异.结果:WT组小鼠血清钙、磷和1,25(OH)2D3浓度均明显高于TG组(P＜0.05),PTH的浓度低于TG组(P ＜0.05);TG组下颌第一磨牙龋损率高于WT组(P＜0.05),前期牙本质厚度高于WT组(P＜0.05),而继发性牙本质面积低于WT组(P ＜0.05);TG组的Biglycan阳性百分比高于WT组(P＜0.05),而DSP阳性百分比低于WT组(P ＜0.05);WT组的ALP和Ⅰ型胶原mRNA表达水平均明显高于TG组(P＜0.05).结论:FGF-23(R176Q)过表达能够抑制牙本质基质形成,减少前期牙本质形成和矿化,减少继发性牙本质形成,进而导致了龋损增加.
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一种红色荧光蛋白转基因小鼠的建立
目的:建立广泛表达红色荧光蛋白(RFP)的转基因小鼠,便于组织和细胞移植研究.方法:把DsRed基因片段插入到pCAGGS载体的强启动子下游构建转基因载体pCAG-DsRed.经细胞转染验证,受精卵原核注射,建立红色荧光蛋白转基因C57BL/6小鼠.PCR鉴定转基因小鼠的基因型;红色荧光蛋白在组织中的表达情况,则通过荧光显微镜检测小鼠各组织器官冰冻切片.结果:pCAG-DsRed载体可以在真核细胞中表达RFP,经基因型分析和表型观察,得到两只红色荧光蛋白的首建鼠.经荧光显微镜观察各组织冰冻切片发现红色荧光蛋白在多个组织器官中表达,其中在神经系统和肌肉组织中表达量较高.结论:成功建立了一种红色荧光蛋白转基因小鼠,红色荧光蛋白在转基因小鼠的神经系统和肌肉组织等中高表达.
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高滴度天然抗角蛋白自身抗体对小鼠机体影响的初步分析
目的:探讨高滴度天然抗角蛋白自身抗体(AK auto Ab)对小鼠多器官系统的影响.方法:AK auto Ab转基因小鼠及同窝对照小鼠于常规条件下饲养,观察小鼠体质量、生存时间等一般情况,Kaplan-Meier法绘制生存曲线.取20周龄以上小鼠检测血常规和血生化值.结果:与同窝对照小鼠相比,转基因小鼠体质量减轻(P＜0.001),生存时间缩短(P＜0.05),脾肿大,肝脏、脾脏、肾脏与体质量的比值增大(P＜0.05);血常规显示白细胞数降低,淋巴细胞数下降(P＜0.001);血小板升高,血清总蛋白升高,尿素氮升高(P＜0.05).结论:AK auto Ab的过度表达可能对小鼠的机体造成一定的损害,对多器官系统也产生重要的影响.本研究对于全面分析天然自身抗体的功能具有重要的意义.
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曲古菌素A和ATRA合用对PLZF-RARα转基因阳性发病鼠骨髓细胞的诱导分化作用
目的:研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A(trichostatin A,TSA)和ATRA对PLZF-RARα转基因发病鼠骨髓细胞的作用. 方法:分子克隆技术构建hCG-PLZF-RARα转基因构件. 显微注射建立仅在髓系细胞中表达PLZF-RARα的转基因小鼠模型. DNA-PCR,Southern blot,RT-PCR,免疫荧光,血象,骨髓象,脾细胞形态,病理等检测分析基因整合表达及发病情况. 取PLZF-RARα转基因发病鼠骨髓细胞体外培养,经TSA和ATRA作用一段时间后,Wright-Giemsa 染色观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞周期、细胞表面分化抗原CD11b和CD117等的表达,荧光免疫细胞化学染色检测融合蛋白表达,硝基蓝四氮唑(NBT)还原试验观察细胞功能分化情况. 结果:TSA(30 μg/L)联合ATRA(1 μmol/L)使发病鼠骨髓细胞核质比缩小,幼稚细胞比例减少,细胞生长增殖受抑,S期细胞减少,PLZF蛋白的表达呈局部聚集的趋势,但NBF还原试验变化尚不明显. 结论:组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA联合ATRA可使PLZF-RARα转基因发病鼠骨髓细胞发生部分分化.
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CpG ODN联合HBsAg免疫BALB/c小鼠和HBV转基因C57BL/6J小鼠
目的:探讨人工合成硫代修饰的含CpG基序的寡脱氧核苷酸(ODN)作为佐剂对HBsAg诱导BALB/c和HBV转基因小鼠产生免疫应答的影响. 方法: 用人工合成CpG ODN与血源HBsAg联合免疫BALB/c和HBV转基因C57BL/6J小鼠,采用ELISA方法观察小鼠血清HBsAg及抗-HBs水平,用ELISPOT方法判断CpG ODN对HBsAg免疫小鼠脾T淋巴细胞分泌细胞因子的影响. 结果: CpG ODN联合HBsAg免疫BALB/c小鼠较HBsAg单独注射组同期抗-HBs滴度明显提高,尤其在首次免疫后6、8、12 wk,2组比较差异显著(P<0.05),联合免疫较CpG ODN单独免疫自首次免疫后4 ～16 wk差异显著(P<0.05).与HBsAg,CpG ODN 单独免疫比较,联合免疫能使HBsAg特异性分泌IFN- γ T细胞分别增加3或9倍;CpG ODN,HBsAg联合免疫可诱导转基因小鼠产生抗-HBs,随时间延长,抗体滴度逐渐升高,并能使更多小鼠产生抗体,而单用HBsAg组、CpG ODN组均不能诱导抗-HBs的产生,免疫后各组血清HBsAg浓度较免疫前明显下降(P <0.05),但组间无明显差别(P>0.05),与HBsAg,CpG ODN 单独免疫比较,联合免疫能使HBsAg特异性分泌IFN- γ T细胞分别增加3或11倍. 结论: CpG ODN作为佐剂可增强HBsAg诱导BALB/c小鼠产生体液及细胞免疫应答,CpG ODN ,HBsAg联合免疫可打破HBV转基因小鼠对HBsAg免疫耐受,可望成为慢性乙型肝炎的有效预防和治疗性疫苗.
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β-肌动蛋白启动子指导下人bcl-2转基因小鼠模型的建立
目的: 通过原核注射法将肌动蛋白启动子/bcl-2基因转入小鼠受精卵,制作转bcl-2基因的小鼠. 方法: 构建β-actin启动子/bcl-2表达载体,小鼠进行超排获得原核期胚胎,应用原核注射法进行转基因操作,对新生小鼠通过基因组DNA PCR和Southern blot方法进行鉴定. 结果: 注射成功率为58%(580/1000),新生小鼠为33只,PCR检测转基因阳性为8只,经过Southern杂交检测有4只转基因阳性鼠. 结论: 通过原核注射法获得转bcl-2基因的阳性小鼠,建立bcl-2转基因动物模型,为脑缺血再灌注损伤的机制研究提供手段.
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人β-珠蛋白MAR对转基因在不同细胞中表达的影响
目的:研究人β-珠蛋白核基质结合区(matrix attachment region,MAR)在不同表达宿主中对转基因表达的影响.方法:通过PCR从人基因组扩增β-珠蛋白MAR,正向克隆至pCAT3-control载体SV40启动子的上游,分别检测在瞬时及稳定表达的情况下,MAR在NIH3T3及Hela细胞中对CAT报告基因的影响情况.结果:在瞬时表达情况下,NIH3T3细胞及Hela细胞中MAR均不能提高CAT基因的表达;在稳定整合的情况下,NIH3T3细胞中β-珠蛋白MAR可使CAT报告基因表达水平提高8倍,而在Hela细胞表达水平只提高2.5倍.结论:MAR能在一定程度上提高稳定外源基因的表达水平;MAR的作用与表达宿主相关.
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大鼠sFGFR1转基因腹主动脉移植模型建立
目的: 建立一种稳定的大鼠sFGFR1转基因腹主动脉移植模型. 为通过基因转染研究慢性排斥反应所致移植器官内动脉血管进行性硬化(AGA)的病变机制及治疗提供实验手段. 方法: 克隆sFGFR1基因,并在RTS系统中高效表达相应蛋白, 构建Adv5-sFGFR1及Adv5-LacZ转基因载体. 供体大鼠经左肾动脉插管,分别灌注Adv5-LacZ及Adv5-sFGFR1 2×109～5×109 Pfu约100～200 μL. 在主动脉充满灌注液后,保持压力20 min . 结扎左肾动脉,切取该段腹主动脉. 原位移植于受体大鼠腹腔内. 于移植后1,3,7,14和28 d,分批活杀受体大鼠,切取移植主动脉,行组织形态学及β-gal染色检查形态学改变LacZ基因表达,及免疫组化染色,RT-PCR检查,观察sFGFR1表达. 结果: 采用阻断腹主动脉,恒压灌注法于转染移植后3,7,14和28 d,免疫组化染色,RT-PCR检查及β-gal染色法可检测到Adv5-LacZ和sFGFR1基因在主动脉血管内皮细胞及间质平滑肌细胞中均有高效表达. 目标基因表达随时间延长有减弱趋势. 组织形态学检查证明转基因主动脉在形态及结构保持正常、完整、无炎症反应等破坏表现. 结论: 通过阻断血管,恒压灌注,可成功将目标基因(LacZ, sFGFR1)转染大鼠主动脉. 移植后目标基因可获得安全、有效表达.
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pcDNA3-hbFGF转染角朊细胞对真皮成纤维细胞增殖的生物学效应
目的:观察含外源性人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)基因的角朊细胞(human keratinocyte,HK),对真皮成纤维细胞(human dermal fibroblast, HDFib)增殖的影响;探讨转hbFGF基因HK对创面愈合的生物学效应及作用机理,为这种转基因HK细胞用于创面基因治疗的可行性提供实验依据.方法:收集含真核表达质粒pcDNA3-hbFGF的HK细胞培养上清,加入培养的HDFib细胞内;MTT法测定细胞的增殖率、3H-TdR掺入法测定细胞DNA合成率、流式细胞仪分析细胞增殖周期.结果:加入转基因HK细胞培养上清的HDFib细胞,培养72h后,较正常对照组、加正常HK培养上清组、加转染空载体pcDNA3-neo的HK培养上清组,其细胞增殖分别增加1.0,1.5,3.0倍(P＜0.01);细胞DNA合成率分别提高1.6,2.3,3.4倍(P＜0.01);HDFib细胞周期分析显示加入转基因HK细胞培养上清24h时细胞处于S期的比例较其余对照组增加明显,至72h时无差别.结论:转染hbFGF基因真核表达质粒的HK细胞可以分泌活性物质促进HDFib细胞DNA合成及增殖;机理为刺激HDFib进入细胞分裂S期,其效应呈现时间依赖性.
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反义X区RNA和反义P区RNA小鼠体内抗HBV的比较
目的:探讨针对乙型肝炎病毒(HBV)X区反义RNA和P区反义RNA对乙型肝炎转基因小鼠HBV复制和表达的影响.方法:构建表达HBV X区反义RNA和P区反义RNA的重组载体质粒,与脂质体混合,经尾静脉注入小鼠体内,用荧光聚合酶链反应定量法检测血清HBV DNA含量,用Nested-PCR法检测血清HBV DNA转阴率.结果:PLXSN-asX小鼠血清HBV DNA的复制于给药后2 d被抑制,至给药后8周抑制依然存在;PLXSN-asP小鼠血清HBV DNA的复制于给药后4 wk被抑制,至给药后8周抑制处于上升趋势. 与给药前相比,小鼠血清HBV DNA的复制,在PLXSN-asX组和PLXSN-asP组分别于2和8 wk达到抑制高峰,抑制率均为58%; 8周后小鼠血清HBV DNA转阴率PLXSN-asX组和PLXSN-asP组分别为25.0%(2/8), 12.5%(1/8).结论:HBV X区反义RNA与HBV P区反义RNA对乙型肝炎病毒转基因鼠抗HBV作用效率无显著差异,但X区反义RNA的起效时间明显早于P区反义RNA.
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HBV转基因小鼠孕前期及孕期应用乙肝疫苗的实验研究
目的:研究乙型肝炎病毒转基因(HBV Tg)小鼠孕前期及孕期应用重组(酵母)乙型肝炎疫苗(rHBv)对降低母血中表面抗原(HBsAg)浓度的作用,以及对母胎安全性的影响.方法:14只HBV Tg雌鼠随机分为A、B两组;12只普通BALB/c雌鼠随机分为C、D两组.A、C组每只于孕前3 wk和怀孕当天分别ip rHBv 10 μg,B、D组每只同时ip生理盐水1mL.HBV Tg鼠均于首次注射前、首次注射后3 wk、首次注射后6 wk采血3次,固相放射免疫定量法测定其血清中HBsAg并分析,ELISA检测有无抗体(抗-HBs).观察4组雌鼠的妊娠生育状况及子鼠的生长发育.结果:A、B组血清HBsAg浓度组间无显著性差异(P＞0.05),A组有4只鼠产生抗-HBs,C组有5只产生抗-HBs.各组胎鼠安全性指标、子鼠的生长发育指标均无统计学差异(P＞0.05).结论:孕期应用rHBv对雌鼠子鼠的安全性影响不明显,但可能由于HBV Tg鼠乙型肝炎病毒(HBV)突变等原因,雌鼠血清中HBsAg浓度并没有明显下降,但在血清中出现了抗-HBs.
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过氧化物酶增殖体激活受体γ2转基因小鼠的制作及其影响因素分析
目的 分析影响转基因小鼠制作的因素,优化转基因动物制作过程,建立适合本实验室的转基因小鼠制作方法.方法 利用显微注射方法制作转基因小鼠,对超数排卵的程序、受精卵的收集、外源基因的显微注射、胚胎移植和术后护理等影响因素都进行了对比研究.结果 优化了转基因小鼠的制作过程,减少了影响胚胎移植成功的不利因素,提高了过氧化物酶增殖体激活受体γ2(PPAR-γ2)转基因小鼠的制作效率(2.9%).结论 成功制作了PPAR-γ2转基因小鼠,优化转基因小鼠的制作程序是提高转基因成功率的可行途径.
关键词： 过氧化物酶增殖体激活受体γ2 转基因 小鼠 影响因素 -
尾加压素Ⅱ转基因家兔制作及其影响因素分析
目的 分析影响转基因家兔制作的因素,优化转基因动物制作过程,建立适合本实验室的转基因家兔制作方法.方法 利用显微注射方法制作转基因家兔,对超数排卵的程序、受精卵的收集、外源基因的显微注射、胚胎移植和术后护理等影响因素都进行了对比研究和探讨.结果 优化了转基因家兔制作过程,通过对比发现注射卵泡刺激素方案优于注射孕马血清方案,更易获得较多数量的受精卵.PCR检验结果显示我们成功获得尾加压素Ⅱ转基因家兔.结论 通过成功制作尾加压素Ⅱ转基因家兔,建立了适合本实验室的转基因家兔制作方法,同时为研究尾加压素Ⅱ生物学功能和其与疾病的关系提供了有力工具.
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超声及超声微泡介导基因转染的可行性研究
目的 探讨超声、超声造影剂微泡介导基因转染的可行性及所需超声照射时间.方法 选择超声能量在MI=1.5,超声频率f=8 MHz,向人脐静脉内皮细胞(HUVEC)悬液加入微泡后分别超声辐照20 s、1、5、10、15、30 min,继续培养24 h.然后用台盼蓝拒染法计数活细胞,各组与对照组(无辐照)行统计学分析,选择超声辐照的佳时长.然后,微泡与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)质粒充分孵育后,采用该时长进行超声微泡介导基因转染试验,细胞继续培养48 h后,通过荧光显微镜观察EGFP的表达.结果 超声辐照10、15、30 min组细胞计数比对照组降低,差异有统计学差异(P＜0.05).利用超声能量在MI=1.5、超声频率f=8 MHz条件下辐照5 min,继续培养48 h后荧光显微镜观察,有EGFP表达,细胞生长良好.结论 超声微泡能够促进质粒进入细胞并转染基因.超声能量MI=1.5、超声频率f=8 MHz时,超声微泡介导基因转染的佳辐照时长为5 min.
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RNA干扰的研究进展
RNA干扰(RNAi)现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制,是指内源性或外源性与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(double-stranded RNA.dsRNA),在细胞内特异地降解该mRNA,从而致使特异性的基因有效封闭的过程.是一种序列特异性的转录后基因沉默.本文对RNAi作用机制特点、生物学意义和应用的研究进展综述如下.
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表达嵌合体蛋白PAcP/CTB的转基因番茄生物学性状的差异分析
目的：研究转基因番茄植株及非转基因番茄植株栽培后的各项农艺性状的变化。方法每周记录转基因番茄及其对照植物生长的一般状况、株高、茎粗和大叶宽等农艺性状。结果转基因番茄植株与非转基因番茄植株生长情况良好，转基因番茄植株的株高、茎粗和大叶宽经统计学分析与对照组番茄植株比较有统计学差异。结论与对照植株相比，本课题组培养的转基因番茄植株在农艺性状上发生不同程度的改变。
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转基因动物模型制作进展
转基因动物是应用实验的方法将外源基因导入到早期的胚胎内,使之可以在动物染色体基因组内稳定的整合,并能遗传给后代的一类动物.随着转基因技术以及分子遗传学的发展,转基因动物模型逐渐应用在医学科学的各个领域.本文对转基因动物模型的几种常用建模方法做一综述,探讨各种不同的转基因动物模型制作方法的优劣.后以显微注射法为例简述制作转基因动物的方法.
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“黄金大米”事件的反思——用科学理性和道德规范做好伦理审查
“黄金大米”事件所暴露的问题既有伦理委员会本身缺乏道德自律的原因,也有相关法规制度设计上的欠缺.强调伦理委员会对知情同意全过程的监管,在伦理审查中引入问责机制,通过制度设计,使伦理委员会的审查和监督的全过程尽可能实行信息公开,加大审查的透明度,尽快出台涉及人的临床研究法律规范.
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时空表达可控性E2F3a转基因小鼠模型的建立
目的：通过观察时空表达可控性E2F3a转基因小鼠模型，探讨建立膀胱癌动物模型的合适方法．方法：培育转基因动物品系，利用组织特异性启动子Uropakin Ⅱ确保转基因表达的空间专一性，利用Doxycycline诱导系统实现转基因表达时间上的调控．结果：经杂交后筛选出阳性纯合子，能可控性地在膀胱组织中表达目的基因E2F3a．结论：利用组织特异性启动子Uropakin Ⅱ和Doxycycline诱导表达系统，可以建立时空表达可控性E2F3a转基因小鼠模型．
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转基因技术中载体系统的研究进展
探索理想的转基因技术是基因治疗的一项重要内容,而实现基因治疗的关键在于目的基因的高效和适度表达,载体系统的选择将直接影响基因治疗的效率和安全性.本文将介绍主要载体系统在转基因技术中的应用、它们各自的优缺点及目前的研究进展.
