明胶降解物对大鼠真皮成纤维细胞增殖及Ⅰ型胶原蛋白分泌的影响

目的 探讨组织工程心瓣膜常用人工基质材料--明胶发生降解后的产物对大鼠真皮成纤维细胞增殖及Ⅰ型胶原蛋白分泌的影响. 方法 利用酶组合技术制备明胶降解物(gelatin hydrolysate, GH),采用超滤的方法分离出低分子量明胶降解物组分(gelatin hydrolysate fraction, GHF),用于5只SD大鼠真皮成纤维细胞的体外培养.采用CCK-8活细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8)检测细胞的增殖情况,ELISA试剂盒检测细胞I型胶原蛋白的分泌情况. 结果 ①GHF对细胞增殖作用的浓度效应:在0.125～1.0 mg/ml浓度范围内,GHF对细胞的促增殖作用呈现先增强后减弱的趋势,在0.25 mg/ml时,细胞增殖率大,达到(47.54±16.35)%;②GH与GHF对细胞增殖影响比较:GH与GHF均具有促进细胞增殖的作用,且在浓度为0.25 mg/ml时,促细胞增殖作用无显著差异[(27.04±15.21)% vs (39.22±15.55)%, P=0.177];③GH与GHF对细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白影响比较:GHF组第3天时Ⅰ型胶原分泌量为(28.06±5.60)pg/105,与空白对照的(18.24±4.52)pg/105相比,有显著差异(P=0.006),而GH组直至第6天时Ⅰ型胶原蛋白分泌量,与空白对照相比,无统计学意义(P=0.103). 结论 分子量大小不同的明胶降解物GH与GHF均具有促进大鼠真皮成纤维细胞增殖的作用,且分子量较小的GHF还具有促进细胞I型胶原分泌的功能.

富血小板血浆对中波紫外线照射成纤维细胞活性氧的影响

目的 探讨富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)对于光老化成纤维细胞活性氧产生的调节作用,以及对光老化成纤维细胞形态与衰老的影响.方法 将成纤维细胞分为UVB组和UVB+ PRP组.采用适宜浓度的PRP处理中波紫外线(UVB)反复照射构建的体外细胞光老化模型,造模结束24 h后,倒置显微镜观察2组细胞形态以及衰老染色阳性率;紫外线单次照射后,荧光显微镜检测2组活性氧的表达量;流式细胞仪检测实验组与对照组活性氧产生的相对荧光强度的大小.结果 PRP能够明显改善由于UVB照射所引起的成纤维细胞肥大铺展的外观,能够明显减少活性氧的产生,降低活性氧的相对荧光强度.结论 PRP能够通过降低UVB照射引起的光老化成纤维细胞的氧化应激水平,减少活性氧的产生量,改善光老化成纤维细胞的相关衰老表型.

P物质上调正常人真皮成纤维细胞TGF-β1的mRNA表达

目的探讨神经肽P物质(Substance P, SP)与瘢痕形成间的调控关系. 方法体外分离培养正常人真皮成纤维细胞,分别加入SP及其受体特异性拮抗剂L-703,606乙酸盐,MTT法测定细胞生长增殖量;采用细胞爬片法培养细胞,加入SP 对细胞作用后,应用TGF-β1 mRNA特异性探针行细胞原位杂交,计算细胞的TGF-β1 mRNA阳性表达率,并经图像分析测定阳性细胞TGF-β1 mRNA的表达强度,分析SP与真皮成纤维细胞TGF-β1 mRNA表达间的关系.结果 SP可促进体外培养的正常人真皮成纤维细胞的生长,其作用与SP浓度呈现依赖关系,当浓度达到25 ng/ml时,刺激细胞生长的速率达大值,可使细胞较对照组提前4 d融合;正常人真皮成纤维细胞受25 ng/ml的SP刺激后TGF-β1 mRNA的表达明显上调,48 h后即可见细胞表达TGF-β1 mRNA的阳性率及强度均显著增加;SP对正常人真皮成纤维细胞的上述效应,均可被其受体拮抗剂L-703,606乙酸盐所抑制.结论 SP可促进正常人真皮成纤维细胞的生长增殖,同时上调细胞的TGF-β1mRNA表达;提示SP可能为皮肤损伤后瘢痕形成过程中启动成纤维细胞表型转化的重要调节因子.

角质形成细胞与皮肤创面愈合瘢痕形成

创伤的愈合是一个复杂的连续的生物学过程,创伤的愈合和组织的重塑有赖于上皮再生、基底膜重建和表皮屏障功能的恢复.随着近年来在细胞生物学、生物化学和分子生物学领域对皮肤创面愈合的研究不断深入,人们对角质形成细胞(KC)在皮肤炎症、创面愈合、瘢痕形成和组织重塑方面起了关键的调节作用这一观点已形成共识.KC是先遭到损伤和外界刺激的细胞,经研究发现,激活的KC所分泌的多种信号多肽可穿过完整的基底膜作用于真皮成纤维细胞(Fb),使Fb的功能和行为发生改变[1].临床上也可见到部分瘢痕疙瘩患者并无明显的外伤史,一些学者认为,这与表皮基底层KC遭到损伤或刺激有关.因此,研究创伤正常愈合中的和异常瘢痕中的KC,对了解疾病的发生机制和临床防治具有重要意义.

盐酸西替利嗪对表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞P物质受体和细胞因子表达的影响

研究抗组胺药盐酸西替利嗪对表皮角质形成细胞系HaCaT细胞和真皮成纤维细胞P物质受体表达以及对P物质诱导两种细胞表达IFN-γ,、IL-1β、IL-6及IL-8的影响.采用流式细胞术和Western blotting检测分析西替利嗪对两种皮肤细胞P物质受体表达的影响;以P物质刺激HaCaT细胞和真皮成纤维细胞,加入不同剂量的西替利嗪共孵育,采用ELISA方法测定西替利嗪对IFN-γ、IL-1β、IL-6及IL-8分泌的影响.结果表明,西替利嗪显著抑制HaCaT细胞和真皮成纤维细胞P物质受体的表达;P物质刺激可以显著增加HaCaT细胞和真皮成纤维细胞IFN-γ、IL-1β、IL-8的分泌量;1～100 μmol·L-1的西替利嗪均可抑制皮肤细胞IL-1β、IL-8的分泌,但对IFN-γ,的分泌无明显影响.P物质和西替利嗪对两种皮肤细胞IL-6的产生均无显著影响.

西替利嗪对皮肤细胞炎症中单核趋化蛋白-1表达的干预作用

目的考察西替利嗪(CET)对皮肤细胞炎症模型中单核趋化蛋白-1(MCP-1)表达的干预作用.方法组胺(HIS)和IFN-γ刺激真皮成纤维细胞(DF)和人角质形成细胞株HaCaT细胞,采用RT-PCR和ELISA法考察两种细胞MCP-1 mRNA和蛋白表达水平.结果与对照组比较,HIS(10 μmol·L-1)和IFN-γ(20 ng·mL-1)组显著上调两种细胞(DF和HaCaT)MCP-1 mRNA表达,同时分别使DF的MCP-1蛋白分泌量增加3.5倍和8.4倍,对HaCaT细胞也有相似的影响趋势;CET(1和10 μmol·L-1)显著地抑制了它们对细胞MCP-1蛋白产生的增强作用.结论CET可能通过抑制MCP-1的表达而发挥抗皮肤炎症作用.

西替利嗪对P物质诱导皮肤细胞单核细胞趋化蛋白-1表达的影响

目的 研究西替利嗪对P物质诱导表皮角质形成细胞系HaCaT细胞和真皮成纤维细胞表达单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的影响.方法 采用MTT法考察西替利嗪对两种皮肤细胞生存性的影响;ELISA方法测定P物质诱导两种皮肤细胞分泌MCP-1的时效关系与量效关系.以P物质刺激HaCaT细胞和真皮成纤维细胞,加入不同剂量的西替利嗪共孵育24 h,测定西替利嗪对MCP-1表达的影响.结果 以10-8mol·L-1 P物质刺激HacaT细胞24 h可以显著增加HaCaT细胞和真皮成纤维细胞MCP-1的分泌量,不同浓度的西替利嗪均可以抑制皮肤细胞MCP-1的分泌.结论 西替利嗪可能通过抑制趋化因子MCP-1的表达而发挥抗皮肤过敏作用.

大鼠真皮成纤维细胞肌肉转录调节因子基因转染后生物学特性观察

背景:利用转基因技术诱导皮肤真皮成纤维细胞分化为特殊器官组织功能的前驱细胞具有重要意义.目的:观察肌肉转录调节因子(myogenic determination,MyoD)基因转染对大鼠真皮成纤维细胞生物学特性的影响.设计、时间及地点:单一样本观察,细胞基因工程学实验,于2005-01/2007-02在同济大学附属东方医院心胸外科和细胞治疗室完成.材料:清洁级雄性SD大鼠6只,购自上海西普尔.必凯实验动物有限公司.Ⅱ型胶原蛋白酶为GIBCO公司产品,稻瘟菌素粉剂为美国Promega公司产品,慢病毒载体pLenti6/V5-DEST为Invitrogen公司产品,BrdU为美国Sigma公司产品.方法:无菌条件下切取大鼠腹侧全层皮肤,采用200 IU/mL的Ⅱ型胶原蛋白酶在4℃下解离大鼠皮肤真皮组织,组织块培养法获取贴擘的真皮成纤维细胞,待生长近融合状态时传代扩增.取传军第3-6代细胞,利用携带MyoD cDNA的真核表达载体pLenti6/V5-DEST-MyoD进行转染:经终浓度为50 mg/L稻瘟菌素筛选后,挑选转基因单克隆细胞传代培养,向细胞培养液中加入10μmol/L BrdU于37℃条件下孵育48 h.主要观察指标:细胞形态学观察.免疫细胞化学染色鉴定,体外BrdU标记情况.结果:体外分离培养的真皮成纤维细胞纯度高,形态良好,生长增殖功能正常,转染后经稻瘟菌素筛选2周即可见克隆形成.光镜下真皮成纤维细胞免疫细胞化学染色后波形蛋白呈阳性表达,转染MyoD基因后肌动蛋白亦呈阳性表达.10 μmol/LBrdU孵育48 h的标记率＞98%,且连续传代5次后仍可检测到BrdU阳性细胞.结论:真核表达载体成功介导MyoD基因转染体外分离培养的大鼠真皮成纤维细胞,并诱导其转化为具有潜在功能的类骨骼肌细胞,可在体外稳定生长扩增.

表皮生长因子促进真皮成纤维细胞生长的机制

目的探讨表皮生长因子( EGF)对真皮成纤维细胞中 cyclinD1和 CDK-4表达的影响,从细胞周期的角度认识 EGF促进真皮成纤维细胞生长的机制.方法研究对象为大鼠真皮成纤维细胞,用含 100 ml/L胎牛血清的 DMEM,加入 50 mg/L的 EGF培养 SD大鼠的真皮成纤维细胞,通过 MTT检测、流式细胞仪分析观察细胞的生长状态,免疫组化检测 cyclinD1和 CDK-4的表达结合流式细胞仪分析来观察细胞的周期变化.结果 MTT检测(加药前 0.37± 0.011,加药后 0.55± 0.008)、流式细胞仪结果(加药前 9.1,加药后 14.7)都显示 50 mg/L的 EGF能显著促进真皮成纤维细胞的生长增殖,免疫组化结果显示,两者一致,加药后阳性明显增强.结论 50 mg/L的 EGF对真皮成纤维细胞的生长有极大地促进作用,促进了细胞周期蛋白 cyclinD1和 CDK-4的表达增强,细胞 G1期变短,增殖能力增强.

比较两种酶消化法对真皮成纤维细胞的影响

背景:目前真皮成纤维细胞研究应用广泛、需求量大、分离方法多,但是用于细胞分离培养的酶消化法尚未有对比研究.目的:比较两种酶消化方法分离的真皮成纤维细胞的细胞产量、形态、迁移、增殖4个方面的差异.方法:分别使用中性蛋白酶+胶原酶或胰蛋白酶分离消化真皮成纤维细胞,并进行细胞计数,原代培养并观察细胞形态学差异,采用细胞划痕实验观察细胞迁移能力并使用CCK-8检测细胞增殖活力.结果与结论:①采用中性蛋白酶+胶原酶消化的成纤维细胞在接种后六七天后融合,通过胰蛋白酶消化分离的成纤维细胞在八九天后融合,两种酶消化法都可获得真皮成纤维细胞;②与胰蛋白酶消化组相比,中性蛋白酶+胶原酶消化组的细胞产量显著增加;③划痕实验结果显示,胰蛋白酶消化的真皮成纤维细胞迁移速度较中性蛋白酶+胶原酶消化的细胞显著减慢;④两种酶消化方法分离的真皮成纤维细胞生长曲线均显示细胞数与培养时间呈正相关关系,在第3,4和5天,中性蛋白酶+胶原酶组的成纤维细胞的吸光度均显着高于胰蛋白酶组细胞的吸光度;⑤结果表明,与胰蛋白酶消化相比,用中性蛋白酶+胶原酶消化的细胞产量、迁移、增殖能力均更高;提示中性蛋白酶+胶原酶消化法优于胰蛋白酶消化法.

应用犬真皮成纤维细胞构建组织工程半月板修复犬半月板缺损的实验研究

目的 探讨体外构建组织工程半月板修复半月板缺损的可行性.方法 将体外扩增至第4代的犬真皮成纤维细胞(Dermal fibroblasts,DFs)接种于PGA/PLA支架材料上,应用软骨形态发生蛋白1(Cartilage-derived morphogenetic protein-1,CDMP1)细胞诱导液体外诱导培养2周后,回植于犬自体半月板缺损模型体内,移植后6个月取材观察半月板的再生情况.结果 诱导组模型内形成较大的新生半月板组织,组织学染色显示诱导组新生组织更接近于半月板组织的生理特点,尤其是内侧部分大部分细胞表现出软骨细胞特有的陷窝结构；非诱导组及空白对照组新生的组织较小,且组织学表现更类似纤维结缔组织.新生半月板Ⅰ型胶原偏振光检测显示,诱导组胶原纤维排列较非诱导组致密,出现Ⅰ型胶原的横纹特征.扫描电镜检测显示,诱导组细胞外基质与正常半月板相比较疏松,非诱导组细胞外基质则更加疏松.膝关节胫骨平台关节软骨的HE染色显示,诱导组关节面的外侧有新生半月板组织覆盖的部位关节软骨尚有部分存余,而诱导组已基本消失.结论 组织工程化细胞材料复合物能在犬自体半月板缺损模型上实现半月板再生.

软骨形态发生蛋白1诱导犬真皮成纤维细胞向软骨细胞表型分化的实验研究

目的 探讨软骨形态发生蛋白1 (Cartilage-derived morphogenetic protein-1,CDMP1)诱导体外培养的犬真皮成纤维细胞(Dermal fibroblasts，DFs)向软骨细胞表型分化的可行性。方法应用CDMP1细胞诱导液对体外扩增至第4代的犬DFs进行诱导培养，观察细胞的形态变化，以免疫荧光染色和RT-PCR检测细胞中软骨特异蛋白的表达情况。结果诱导培养6d后，实验组部分DFs呈星形或多角形，免疫组化染色显示有软骨特异的Ⅱ型胶原分泌,RT-PCR检测也表明有Ⅱ型胶原、aggrecan和SOX9表达。但是诱导培养10d后，均转为阴性。结论CDMP1可以诱导犬DFs向软骨细胞表型分化，有可能成为组织工程化纤维软骨的种子细胞。

真皮成纤维细胞多向分化潜能的研究进展

真皮成纤维细胞起源于胚胎中胚层间质细胞,是构成体内疏松结缔组织的主要细胞成分.以往认为,真皮成纤维细胞在机体发育过程中是分化完全的终末细胞,不具备多向分化潜能,只能作为真皮组织的种子细胞.近年来研究发现,真皮成纤维细胞能够表达间充质干细胞相关标志物,具有多向分化潜能,在特定条件下能够向骨、脂肪、软骨、肌腱、神经以及胰岛等多胚层组织器官分化,可能成为组织器官构建的种子细胞来源.现将真皮成纤维细胞的多向分化潜能研究现状进行综述.

芥子气诱导人真皮成纤维细胞凋亡的研究

目的:研究芥子气诱导真皮成纤维细胞凋亡的作用,探讨其治疗银屑病的作用机制.方法:采用MTT法检测不同浓度芥子气对真皮成纤维细胞增殖的抑制作用,采用Annexin V-FITC法检测芥子气对真皮成纤维细胞凋亡指数的影响,以免疫组化法考察芥子气对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体1(TRAILR1)表达的影响.结果:不同浓度的芥子气对真皮成纤维细胞的增殖均有抑制作用(P<0.01),并呈明显的剂量依赖性.真皮成纤维细胞的凋亡指数随着芥子气浓度的增加而增加.免疫组化考察结果表明,在芥子气的作用下,TRAILR1在人真皮成纤维细胞的胞膜和胞浆成强阳性表达.结论:芥子气可抑制真皮成纤维细胞的增殖,诱导其凋亡,该效应可能与芥子气促进TRAILR1的表达有关,从而可用于银屑病的治疗.

芥子气促进真皮成纤维细胞分泌IL-10的时效和量效研究

目的:探讨芥子气诱导真皮成纤维细胞分泌IL-10的规律.方法:采用ELISA方法,检测不同浓度梯度的芥子气调节IL-10分泌的量效和时效关系.结果:成纤维细胞自身可分泌一定量的IL-10,芥子气作用成纤维细胞后,显著上调IL-10的分泌(P<0.05).并呈时间依赖性和剂量依赖性.结论:芥子气治疗银屑病的作用机制可能与促进细胞分泌抗炎因子IL-10有关.

人表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞对蛋白激酶C激活的不同生物学效应

细胞信号传导调节通路主要包括蛋白激酶A（PKA）、蛋白激酶C（PKC）、酪氨酸激酶等酶系统。它们广泛参与细胞的各种生物学过程如增殖、分化、基因的表达和功能蛋白的合成等[1,2]。PKC是其中重要的调节通路。已发现人角质形成细胞和真皮成纤维细胞中均有PKC的多种亚型，但是对这两种细胞在PKC激活后生物学效应的比较研究甚少。我们通过体外实验，观察了PKC激活剂乙酸肉寇佛泊酯（PMA）刺激后角质形成细胞和真皮成纤维细胞在形态学、细胞增殖以及细胞因子产生等方面的变化，发现这两种细胞在PKC激活后生物学效应存在差异。一、材料角质形成细胞和真皮成纤维细胞来自接受包皮环切的青年男子。细胞培养皿、培养板购自Dako公司，培养基购自Gibco公司，PMA购自Sigma公司，四甲基偶氮唑盐(MTT)购自Serva公司，前列腺素E1(PGE1)购自Ono公司,白介素(IL)-1α、IL-8检测酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒购自晶美公司。cAMP检测药盒购自YamasaShoyu公司。

使用体外重建皮肤模型研究真皮成纤维细胞对皮肤色素沉着的重要调节作用：皮肤光老化的影响

已有大量研究强调了人类角质形成细胞在皮肤色素沉着中所起的作用。例如，角质形成细胞通过释放大量的促色素沉着旁分泌生长因子，如αMSH、内皮素1（ET?1）、干细胞因子（SCF）和多种细胞因子，参与紫外线（UV）急性照射诱导的黑素合成（晒黑）。然而，越来越多的证据显示，真皮内成分在皮肤色素沉着调控中的作用不容忽视。20世纪90年代中期，证实细胞外基质（ECM）可调节黑素细胞的增殖、凋亡抑制和黑素生成活性。有报道证实，真皮成纤维细胞可通过分泌可溶性因子对色素沉着起调控作用。另外，对于构成性肤色，研究发现在掌跖，由成纤维细胞产生的Dikkopf?1（DKK?1）对黑素细胞的生长、活性以及对黑素小体转移均有抑制作用，且认为是这两处身体部位颜色较浅的原因。反之，深肤色皮肤内成纤维细胞分泌的神经调节蛋白1（NGR?1）的促色素沉着效应提示，该特定信号分子在决定高度色素沉着的皮肤类型中发挥作用。此外，在各种先天性色素沉着过度障碍中，如系统性硬皮病、皮肤纤维瘤、多发性神经纤维瘤的咖啡牛奶斑和泛发性进行性色素异常症，已知真皮黑素生成生长因子数量增加；这些因子包括SCF、肝细胞生长因子（HGF）或角质形成细胞生长因子（KGF）。表皮与细胞间质之间紧密的互动也可能在黑素细胞内稳态中发挥作用。近已证实，层粘连蛋白332可通过调节L酪氨酸摄取来促进黑素生成。生长因子/细胞因子调节环也存在于真皮细胞和表皮细胞之间，并参与色素沉着的调控。

高加索人和非洲人皮肤真皮在形态和功能上的差异

关于非洲人和高加索人在皮肤色素沉着、角质层屏障功能以及相关的光防护能力上存在差异的报道较多,但对两者间的形态及可能与形态相关的生物功能差异则了解甚少.该文通过比较组织病理切片的形态以及真皮成纤维细胞不同亚群的培养上清液中分泌蛋白的差异,探讨高加索人及非洲人皮肤除色素差异之外的特点.

老化影响人乳头层真皮成纤维细胞而非网状层真皮成纤维细胞的功能:皮肤形态发生与老公的新观点

P物质受体在人表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞中的表达调控

目的考察P物质受体(Neurokinin-1R, NK-1R)在正常人表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞中的表达调控特征.方法培养人表皮角质形成细胞株HaCaT细胞和真皮成纤维细胞,应用免疫组织化学法检测NK-1R在两种细胞中的表达;采用RT-PCR方法检测NK-1R在两种细胞mRNA水平的表达特征,并采用流式细胞术定量检测在不同刺激因素及药物作用下两种细胞中NK-1R的表达调控情况.结果 NK-1R在HaCaT细胞及真皮成纤维细胞中均有表达,阳性部位位于细胞膜及细胞质.NK-1R mRNA在HaCaT细胞上的表达水平要高于在真皮成纤维细胞上的表达.P物质和IFN-γ可以上调NK-1R在两种细胞上的表达,而LPS抑制了NK-1R的表达;抗组胺药盐酸西替利嗪和P物质受体特异性拮抗剂Spantide I可以降低两种细胞上NK-1R的表达.结论皮肤角质形成细胞和真皮成纤维细胞在细胞、蛋白及mRNA水平均有NK-1R的表达,而且这种表达可被过敏炎症因子调控,提示角质形成细胞和真皮成纤维细胞参与了皮肤免疫调控,神经肽P物质可能在皮肤过敏性炎症中起重要作用.