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EB病毒早期基因BHRF1转基因小鼠纯合子建立及建系
目的 构建整合有EB病毒(EBV)早期基因BamHI-H右向读码框1(BHRF1)基因纯合子转基因小鼠.方法 通过显微注射技术构建BHRF1阳性首建鼠F0共16只,将转基因小鼠与正常小鼠交配,得到子代F1小鼠,PCR技术检测子鼠鼠尾组织DNA,鉴定筛选BHRF1阳性鼠.阳性鼠再与同系阴性鼠杂交得到F2小鼠,筛选出F2小鼠中的阳性鼠近交得F3小鼠.筛选出F3小鼠中的纯阳性鼠进行近交,得到纯阳性F4小鼠.F4小鼠再近交得到纯阳性F5小鼠.结果 经PCR及测序证实,F4、F5小鼠均为BHRF1阳性鼠,测序结果经blast比对,与BHRF1基因完全相同.结论 本实验首次建立了BHRF1转基因鼠模型,并成功筛选出纯阳性BHRF1转基因小鼠,为深入研究BHRF1的生物学特性及其在EBV相关肿瘤发生发展中的作用提供了理想的动物模型.
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EB病毒早期基因BHRF1转基因模型鼠的建立
目的 构建稳定表达EB病毒早期基因BHRF1蛋白的重组载体,通过显微注射法建立BHRF1转基因鼠模型.方法 自EBV阳性细胞系B95-8提取总RNA,应用RT-PCR扩增BHRFI基因,然后与pcDNA3.1(+)连接,构建pcDNA3,1-BHRF1重组载体.重组载体用Nru Ⅰ和Dra Ⅲ双酶切,电泳后纯化回收长约2 000 bp的目的 片段溶于显微注射缓冲液.从超排小鼠取健康受精卵.通过显微注射技术,将纯化的CMV+BHRF1+potyA DNA片段注射入小鼠受精卵,短暂培养后选择健康受精卵移人假孕母鼠输卵管内.采用PCR检测子鼠鼠尾组织DNA,鉴定筛选BHRF1阳性首建鼠.结果 经PCR、限制性内切酶鉴定及测序证实pcDNA3.1-BHRF1重组载体构建成功,Dra Ⅲ和Nru Ⅰ双酶切获得长约2 000 bp的CMV+BHRF1+polyA DNA片段.自18只见栓超排小鼠获取健康受精卵480枚.分别注入纯化的目的 片段,经短暂培养后390枚受精卵仍健康,移入14只假孕母鼠输卵管内,11只受孕,产下74只子鼠.PCR检测子鼠鼠尾DNA获得16只阳性首建鼠.阳性率为21.6%(16/74).结论 本实验首次建立了BHRF1转基因鼠模型.为深入研究BHRFl的生物学特性及其在EBV相关肿瘤发生发展中的作用提供了理想的动物模型.
