荧光标记大鼠全角膜新生血管和淋巴管的方法研究
摘要： 目的 探讨标记大鼠全角膜新生血管和淋巴管的方法.方法 应用心脏灌注荧光联合全角膜免疫荧光法,共焦显微镜下区分并标记全角膜的新生血管和淋巴管.结果 适度的抗体浓度和灌注时间下可标记出全角膜新生血管和淋巴管.血管呈黄绿色,淋巴管呈红色.结论 心脏灌注荧光联合全角膜免疫荧光法可用于标记大鼠全角膜新生血管和淋巴管.
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溴芬酸钠滴眼液对碱烧伤诱导大鼠角膜新生血管的抑制作用
目的 探讨溴芬酸钠滴眼液对碱烧伤诱导的大鼠角膜新生血管(CNV)的抑制作用.方法 健康清洁级成年雄性SD大鼠192只,任意取172只大鼠通过碱烧伤法建立右眼CNV模型,按照随机数字表法分为CNV组、模型对照组、溴芬酸钠组和氟米龙组,每组43只大鼠43只眼,其余20只大鼠40只眼为正常对照组,不做任何处理.模型对照组、溴芬酸钠组和氟米龙组于造模后第1天分别给予PBS、溴芬酸钠滴眼液及0.1％氟米龙滴眼液连续点眼21d.造模后每日裂隙灯显微镜下观察各组大鼠角膜、前房及CNV生长情况,并于造模后1、3、7、14、21、28 d行裂隙灯显微镜照相,计算CNV面积比率;于造模后7、14、28 d每组制作眼球石蜡切片,行苏木精-伊红染色及免疫组织化学染色,检测角膜中CD45及血管内皮生长因子(VEGF)-A的表达;取实验眼角膜组织,采用实时荧光定量PCR法检测角膜组织中环氧合酶(COX)-2及VEGF mRNA含量,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测角膜组织中COX-2及VEGF蛋白含量. 结果 造模后1d,各模型组角膜水肿、混浊;造模后7d,角膜水肿持续加重;造模后14d,角膜混浊、水肿程度逐渐减轻;造模后28 d,CNV组、模型对照组有白斑形成,溴芬酸钠组和氟米龙组有角膜云翳.造模后7、14、21、28 d,溴芬酸钠组和氟米龙组CNV面积比率均较CNV组和模型对照组低,差异均有统计学意义(均P＜0.05);各时间点溴芬酸钠组与氟米龙组CNV面积比率比较,差异均无统计学意义(均P＞0.05).组织病理学染色及免疫组织化学染色显示,造模后7d,各模型组角膜上皮变薄,基质层水肿增厚,胶原纤维排列紊乱,VEGF-A阳性表达;仅CNV组及模型对照组存在少量CD45阳性炎性细胞浸润.造模后14d、28 d,各组角膜上皮角化,基质水肿逐渐减轻,均未见炎性细胞浸润,CNV组、模型对照组角膜中央可见CNV.荧光定量PCR结果显示,造模后7d,CNV组、模型对照组角膜COX-2及VEGF mRNA相对表达量均明显高于正常对照组、溴芬酸钠组和氟米龙组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).ELISA检测结果显示,造模后7d、14 d,溴芬酸钠组COX-2及VEGF蛋白表达量明显低于CNV组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).模型对照组和溴芬酸钠组角膜穿孔发生率均为10％(1/10),氟米龙组角膜穿孔发生率达30％ (3/10),各造模组前房积血发生率为10％ ～ 30％. 结论 溴芬酸钠滴眼液可抑制大鼠碱烧伤后CNV的形成与发展,这一作用可能是通过调节COX-2表达、减轻炎症反应和抑制VEGF产生介导的.
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Sema3A对小鼠原代视网膜神经节细胞轴突生长的抑制作用
目的 观察Sema3A对小鼠原代视网膜神经节细胞(RGCs)轴突生长的作用. 方法 生后24 h内的C57BL/6小鼠,颈椎脱臼法处死后取出眼球,剥离出视网膜组织原代培养RGCs,采用Brn3a免疫荧光染色法鉴定RGCs.将培养7d的RGCs分为对照组、0.05 μg/ml Sema3A组、0.10 μg/ml Sema3A组和0.50 μg/ml Sema3A组,分别加入相应质量浓度Sema3A处理2h,采用免疫荧光染色法检测各组细胞中神经元特异性标志物β3-tubulin、树突标志物MAP2的表达,β3-tubulin+/MAP2-鉴定为轴突,采用Image J软件测量轴突长度;选取0.1μg/ml Sema3A处理组和对照组细胞,分别于处理后0.5、1和2h测量轴突长度.根据不同药物处理方式将细胞分为对照组、Sema3A处理组、Y27632处理组和联合处理组,观察并比较各组轴突长度变化.结果 原代培养的细胞Brn3a呈阳性表达,鉴定为RGCs.培养后7d,RGCs趋于成熟,有完整、细长的神经元突起,可见分支.0.05 μg/ml Sema3A、0.10 μg/ml Sema3A、0.50 μg/ml Sema3A组轴突长度分别为(69.35±1.49)、(60.45±1.42)和(93.65±1.86) μm,均明显短于对照组的(109.80±2.29) μm,差异均有统计学意义(均P＜0.01).0.1μg/ml Sema3A组1h和2h后细胞轴突长度分别为(165.00±4.39)μm和(97.63±2.79) μm,明显短于相应时间对照组的(210.40±4.44) μm和(199.00±4.36) μm,差异均有统计学意义(均P＜0.01);对照组、Sema3A处理组、混合处理组和Y27632处理组轴突长度总体比较,差异有统计学意义(F=142.50,P＜0.01),其中Sema3A处理组RGCs轴突长度明显短于对照组和混合处理组,差异均有统计学意义(均P＜0.01).结论 Sema3A对小鼠原代RGCs轴突生长具有抑制作用,ROCK信号通路抑制剂可减轻Sema3A对轴突生长的抑制作用.
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京尼平交联兔角膜基质有效性和安全性在体研究
目的 观察不同质量分数京尼平交联活体正常兔角膜的有效性及对角膜基质细胞形态的影响.方法 选取40只健康新西兰白兔的右眼为实验眼,采用随机数字表法随机分为0.20％京尼平组、0.25％京尼平组、核黄素组和正常对照组.交联前、交联后7d及14d时,活体测量实验眼的平均角膜曲率(Km)和中央角膜厚度(CCT).角膜交联后7d和14d,各组分别取5只实验眼角膜进行单轴拉伸法测量应变为10％的角膜弹性模量和应力;使用普通光学显微镜和透射电子显微观察角膜基质细胞结构. 结果 各组交联前、交联后7d和14 d Km均数的总体比较,差异均无统计学意义(F时间=1.287,P=0.284;F组别=0.301,P=0.825).各组交联前、交联后7d和14 d CCT均数的总体比较,差异有统计学意义(F时间=3.786,P=0.029),与交联前相比,各组交联后7 d CCT均明显增加,差异均有统计学意义(均P＜0.05);各组间CCT比较,差异无统计学意义(F分组 =0.557,P=0.646).交联后7d,0.20％京尼平组、0.25％京尼平组、核黄素组和正常对照组的角膜弹性模量依次为(11.96±5.74)、(21.24±6.77)、(18.76±3.34)和(11.56±4.37) MPa,应力依次为(0.68±0.24)、(1.20±0.25)、(1.01±0.30)和(0.69±0.26) MPa;其中0.25％京尼平组弹性模量和应力高于0.20％京尼平组和正常对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.05),核黄素组与0.25％京尼平组弹性模量和应力比较,差异均无统计学意义(均P＞0.05).交联后14 d,0.20％京尼平组、0.25％京尼平组、核黄素组和正常对照组的弹性模量依次为(16.65±3.19)、(19.12±2.39)、(22.83±4.38)和(12.70±2.72) MPa,应力依次为(0.83±0.12)、(0.97±0.04)、(1.23±0.30)和(0.65±0.20) MPa;其中核黄素组弹性模量和应力高于0.20％京尼平和正常对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.05),核黄素组与0.25％京尼平组弹性模量比较,差异无统计学意义(P=0.090),核黄素组应力高于0.25％京尼平组,差异有统计学意义(P=0.046).光学显微镜下0.20％和0.25％京尼平组浅层角膜基质细胞密度降低,核黄素组浅层至中层角膜基质细胞消失.透射电子显微镜下可见,0.20％和0.25％京尼平组少量基质细胞内出现空泡,形态大致正常;核黄素组大量细胞凋亡,仅深层基质细胞形态正常.结论 0.25％京尼平可加强角膜的生物力学特性,达到与紫外线-核黄素交联相似的强度;0.20％及0.25％京尼平交联对角膜基质细胞的安全性优于紫外线-核黄素交联.
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康柏西普对兔眼准分子激光角膜切削术术后角膜上皮下雾状混浊的影响
目的 探讨康柏西普(conbercept)对兔眼准分子激光角膜切削术术后角膜上皮下雾状混浊(haze)的影响. 方法 采用随机数字表法将64只纯种新西兰大白兔分为单纯手术组、生理盐水组、conbercept 0.5 mg组和conbercept 1.0mg组,每组16只,均行右眼准分子激光角膜切削术(PRK),术后单纯手术组不做任何处理,其余3个组分别给予术眼结膜下注射生理盐水0.05 ml、conbercept 0.5 mg(0.05 ml)和conbercept 1.0 mg(0.10 ml),另选取8只兔作为正常对照组.术后裂隙灯显微镜下观察角膜上皮愈合情况及haze程度并进行Fantes分级,各手术组术后1周和4周分别空气栓塞法处死8只,正常对照组处死4只,取其角膜组织行苏木精-伊红染色,并通过免疫组织化学法检测角膜组织中转化生长因子-β1(TGF-β1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的表达. 结果 术后兔眼角膜上皮均于3～5d完全愈合,各组兔眼术后角膜上皮愈合时间比较,差异无统计学意义(F=0.37,P=0.77).在观察期间,各手术组haze均于术后4周时明显,conbercept 1.0 mg组haze严重,其次为单纯手术组和生理盐水组,conbercept 0.5 mg组haze较其他手术组明显减轻,各组兔眼不同时间点haze分级比较,差异均有统计学意义(F组别=20.114,P=0.000;F时间=8.084,P=0.006).苏木精-伊红染色示PRK术后1周,术区角膜上皮细胞增生,细胞排列紊乱、形态各异,浅基质层成纤维细胞数量增多,胶原纤维排列紊乱.角膜上皮及浅基质层的增生程度由强到弱依次为conbercept 1.0 mg组、单纯手术组和生理盐水组、conbercept 0.5 mg组.术后4周各手术组术区角膜组织结构较术前1周紊乱,各组增生程度次序同术前1周.免疫组织化学法检测显示,术后1周conbercept 1.0 mg组术区角膜组织中TGF-β1、α-SMA和MMP-2的表达强,其次为单纯手术组和生理盐水组,conbercept 0.5 mg组次之,各手术组3种因子的表达较正常对照组明显增强,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 Conbercept适量结膜下注射可抑制haze的形成,抑制角膜上皮和浅基质层的增生,过量则促进haze的形成,促进角膜上皮和浅基质层的增生.
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脑衰反应调节蛋白2在单眼形觉剥夺性弱视大鼠视皮层的表达
目的 研究脑衰反应调节蛋白2(CRMP-2)在单眼形觉剥夺性弱视大鼠视皮层的表达.方法 出生后14 d的SD健康大鼠64只,采用随机数字表法分为单眼形觉剥夺性弱视组和正常对照组.单眼形觉剥夺性弱视组于出生后14d行右眼睑缘缝合术,单眼形觉剥夺性弱视组和正常对照组分别于出生后14、21、45和120 d各取8只大鼠进行观察.在出生后21 d(单眼剥夺7d)对大鼠行闪光视觉诱发电位(F-VEP)检测,记录P1波的潜伏期和波幅值.利用免疫组织化学检测法观察2个组大鼠视皮层中CRMP-2免疫阳性神经元的表达变化,通过图像分析系统测定平均吸光度(A)值.结果 F-VEP检查结果显示,与正常对照组相比,形觉剥夺性弱视组P1波潜伏期延长,波幅降低,差异均有统计学意义(t=16.760,P=0.000;t=-22.919,P=0.000).免疫组织化学检测显示,单眼形觉剥夺性弱视组和正常对照组大鼠出生后不同时间点视皮层中CRMP-2的表达量比较,差异均有统计学意义(F分组 =8.855,P=0.010;F时间=63.091,P=0.000),其中出生后21、45和120 d单眼形觉剥夺性弱视组CRMP-2的表达量较正常对照组明显降低,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 CRMP-2可能参与单眼形觉剥夺性弱视的发生和发展过程,但其具体作用机制还有待进一步研究.
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圆锥角膜相关成纤维细胞的培养与鉴定
目的 分离、培养并鉴定人圆锥角膜相关成纤维细胞(HKCs).方法 采用组织块贴壁法培养HKCs和正常人角膜成纤维细胞(HCFs),倒置相差显微镜和电子显微镜下分别观察细胞形态和超显微结构,细胞计数试剂盒-8(CC K-8)法检测细胞增生,Western blot法检测成纤维细胞标志性蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及α1-1型胶原蛋白(COL1 A1)和α1-3型胶原蛋白(COL3A1)蛋白的表达水平. 结果 与HCFs相比,HKCs生长速度较快,胶原纤维变细减少,线粒体肿大,嵴消失,高尔基体明显扩张,内质网严重肿胀.培养后不同时间点2种角膜成纤维细胞A值比较,差异均有统计学意义(F组间=5 023.13,P＜0.01;F时间=38 518.16,P＜0.01),其中同一时间点HKCs细胞A值均明显大于HCFs细胞A值,差异均有统计学意义(均P＜0.01).HKCs和HFCs中α-SMA的相对表达量分别为120.00±5.77和100.00±0.00,COL3A1的相对表达量分别为158.33±4.41和100.00±0.00,COL1A1相对表达量为88.33±1.67和100.00±0.00,HKCs中α-SMA和COL3A1的相对表达量均较HCFs明显升高,HKCs中COL1A1的相对表达量较HCFs明显降低,差异均有统计学意义(t=-3.46,P＜0.05;t=-13.23,P＜0.01;t=7.00,P ＜0.05).结论 成功培养并鉴定HKCs,该细胞适用于建立体外圆锥角膜细胞模型.
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Ngn2基因转染对小鼠体外培养三维视杯结构视网膜神经元分化的调控作用
目的 探讨Ngn2基因对小鼠体外培养三维视杯结构视网膜神经元分化的调控作用. 方法 采用小鼠诱导多能干细胞(iPSC)在特定条件下体外培养获取视泡结构(OV),OV培养过程中通过慢病毒介导Ngn2基因多次转染OV,并在OV发育成熟后进行诱导,促进OV内细胞向视网膜神经细胞的特异性分化.以绿色荧光蛋白(EGFP)基因作为对照,免疫荧光法检测OV内视网膜神经细胞的分化情况,采用逆转录PCR和Western blot法定量检测OV内视网膜神经细胞特异性蛋白Pax6、Islet1和Brn3b基因和蛋白的表达情况.结果 成功培养出小鼠iPSC来源的OV.慢病毒介导下经Ngn2基因诱导的OV组织内部神经细胞的分化数量增加.逆转录PCR和Western blot法定量检测结果显示,Ngn2转染组OV内视网膜神经细胞特异性蛋白Pax6、Islet1和Brn3b在基因及蛋白水平的相对表达量均明显高于EGFP转染组,差异均有统计学意义(均P＜0.05). 结论 Ngn2基因转染可有效提高OV内视网膜神经细胞的分化数量,使体外培养的OV发育更为成熟,形成更为完善的视网膜细胞神经环路.
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缺血-再灌注损伤鼠模型中视网膜微循环的结构损伤
目的 研究视网膜缺血-再灌注损伤(RIR)鼠模型中视网膜微循环变化的特征及机制.方法 选取健康C57BL/6雄性小鼠90只,采用随机数字表法将小鼠随机分为正常对照组和DIR组,每组45只,正常小鼠左眼作为正常对照组,视网膜RIR模型小鼠左眼为RIR组.采用生理盐水前房灌注法建立鼠RIR模型.采用视网膜铺片血管染色、FITC造影、组织病理学检查及透射电子显微镜观察从视网膜不同分级的血管结构、功能方面对微循环的结构损伤进行研究. 结果 RIR组大鼠视网膜动脉直径与正常对照组比较差异无统计学意义(P=0.350);RIR组大鼠视网膜静脉直径较正常对照组明显增加,差异有统计学意义(P=0.003);RIR组大鼠视网膜动静脉直径比值为0.76±0.03,较正常对照组的0.97±0.01明显减小,差异有统计学意义(P=0.000).RIR组大鼠实验眼可见毛细血管闭塞、无灌注区等结构改变,并伴随血-视网膜屏障功能损伤.透射电子显微镜检查可见毛细血管内皮细胞和周细胞破坏及基底膜增厚. 结论 RIR主要以毛细血管的损伤为主,主要表现为毛细血管的屏障功能破坏、闭塞、无灌注区形成.
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正常人眼结膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞过程中p53的表达变化及其对微小RNA-29b表达的影响
目的 检测正常人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)活化为肌成纤维细胞(MFs)过程中微小RNA(miR)-29b和p53的表达水平,探讨p53表达变化对miR-29b表达的影响. 方法 收集安徽医科大学第一附属医院2016年3-7月行眼科斜视手术术眼正常Tenon囊组织,用组织块培养法培养出原代HTFs,传代至2～4代并进行实验.将细胞分为4个组:HTFs组细胞常规培养;TGF-β1活化组细胞用10 ng/ml TGF-β1处理;将成纤维细胞活化为肌成纤维细胞;siRNA转染组及阴性对照组分别采用含p53 siRNA以及阴性siRNA转染细胞后经10 ng/ml TGF-β1活化.分别采用免疫组织化学染色法和细胞划痕实验检测HTFs组和TGF-β1活化组细胞p53蛋白表达水平及细胞迁移能力.采用荧光定量PCR法检测各组细胞miR-29b和p53 mRNA相对表达量. 结果 原代HTFs呈长梭形,细胞间呈螺旋状排列,TGF-β1活化后细胞转化为MFs,细胞形态不规则,排列呈无序状态.TGF-β1活化组细胞中p53蛋白染色强度显著强于HTFs组,差异有统计学意义(t=-10.384,P＜0.05).TGF-β1活化组细胞的相对迁移距离明显大于HTFs组细胞,差异有统计学意义(t=9.750,P=0.000).HTFs组、TGF-β1活化组、siRNA转染组及阴性对照组细胞中p53 mRNA相对表达量分别为1.00±0.00、3.95±2.61、0.06±0.06和0.98±0.16,miR-29b相对表达量分别为1.00±0.00、0.54±0.09、5.10±2.31和1.03±0.09,总体比较差异均有统计学意义(F=6.688,P=0.006;F=13.640,P=0.000).TGFβ1活化组细胞p53 mRNA相对表达量显著高于HTFs组和siRNA转染组,miR-29b相对表达量显著低于HTFs组和siRNA转染组,差异均有统计学意义(均P＜0.05). 结论 在HTFs转变为MFs过程中,p53显著升高,miR-29b明显降低;抑制p53表达后,miR-29b表达升高.p53与miR-29b之间可能存在相互作用来调控纤维化瘢痕的形成.
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小鼠视锥细胞系661W细胞凋亡模型的构建及自噬对其的保护性作用
目的 构建小鼠视锥细胞系661W细胞凋亡模型,探讨不同自噬水平下细胞生存状态的变化.方法 采用不同质量浓度抗Fas抗体处理细胞,采用Western blot法检测caspase-3蛋白表达量,并确定凋亡细胞模型适宜抗Fas抗体刺激浓度;分别采用不同浓度自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)和自噬诱导剂雷帕霉素处理细胞,采用Western blot法检测细胞中微管相关蛋白质1轻链3(LC-3)Ⅱ/LC-3 Ⅰ蛋白表达,筛选合适的作用浓度.将细胞分为空白对照组、单纯3-MA组、单纯雷帕霉素组、模型对照组、模型+3-MA组、模型+雷帕霉素组,采用Western blot法检测各组细胞诱导后0、3、6、12、24和48 h caspase-3、caspase-8、自噬相关基因5(Atg-5)和LC-3Ⅱ/LC-3 Ⅰ蛋白表达,采用流式细胞术检测细胞凋亡率.结果 成功构建661W细胞凋亡模型,抗Fas抗体的适宜刺激质量浓度为2.0μg/ml;在Fas抗体刺激下,661W细胞caspase-3、caspase-8相对表达量从6h开始增加,12h达高峰,并持续至48 h,而Atg-5和LC-3Ⅱ/LC-3 Ⅰ蛋白相对表达量从3h开始增加,24 h达高峰,并于48 h时降至基线水平.3-MA和雷帕霉素的适宜作用浓度分别为20 nmol/L和2.0 nmol/L.空白对照组、单纯3-MA组和单纯雷帕霉素组诱导后各时间点caspase-3、caspase-8的相对表达量及细胞凋亡率总体比较,差异均无统计学意义(均P＜0.05).单纯雷帕霉素组各时间点细胞Atg-5和LC-3Ⅱ/LC-3 Ⅰ蛋白相对表达量显著高于相应时间点空白对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).模型+3-MA组caspase-3、caspase-8相对表达量以及细胞凋亡率在诱导后3、6、12、24和48 h均显著高于模型对照组,Atg-5和LC-3Ⅱ/LC-3 Ⅰ的相对表达量在诱导后3、6、12和24 h均明显低于模型对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.05);模型+雷帕霉素组caspase-3、caspase-8相对表达量以及细胞凋亡率在诱导后6、12、24和48 h均显著低于模型对照组,Atg-5和LC-3Ⅱ/LC-3 Ⅰ的相对表达量在诱导后3、6、12和24 h均明显高于模型对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 在抗Fas抗体诱导661W细胞凋亡条件下,增强自噬可降低细胞凋亡率,而抑制自噬则会增加细胞凋亡率,自噬可能对661W细胞起到保护性作用.
