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二氧化硅诱导的肺纤维化中miR-149对白细胞介素-6的调节
目的 探讨miR-149在SiO2诱导的肺纤维化中对白细胞介素-6(IL-6)表达水平的调节作用.方法 (1)建立SiO2粉尘诱导的小鼠肺纤维化模型,实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chainreaction,qRT-PCR)检测小鼠肺组织miR-149表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)和免疫组织化学法观察白细胞介素-6(IL-6)的蛋白表达情况.(2)应用具有肺泡Ⅱ型上皮细胞特性 的(A549)及支气管上皮细胞(HBE)构建SiO2粉尘刺激的呼吸系统上皮细胞模型,应用qRT-PCR检测miR-149水平,用Western blot法检测IL-6蛋白表达情况.(3)通过体外转染miR-149相似剂(mimics)及抑制剂(inhibitors)至A549细胞,Westem blot法检测细胞表达炎症因子IL-6蛋白的表达情况.(4)双抗夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测煤工尘肺患者血清中IL-6蛋白的表达情况.结果 (1)在SiO2诱导的小鼠肺纤维化模型中,与空白对照组比较,SiO2处理后的3个时间点,小鼠肺组织miR-149表达明显下调,而IL-6蛋白表达明显上调,差异有统计学意义(P＜0.01).(2)在粉尘刺激上皮细胞模型中,A549细胞及HBE细胞经SiO2刺激后,IL-6蛋白表达上调,miR-149表达量明显下调,差异有统计学意义(P＜0.01).(3)对A549细胞转染miR-149相似物及抑制剂后实验结果显示,高表达miR-149后,A549细胞IL-6蛋白表达下调,反之亦然.(4)与对照组比较,Ⅱ期、Ⅲ期煤工尘肺组血清IL-6水平明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 (1)SiO2粉尘所诱导的肺纤维过程中miR-149表达降低,IL-6蛋白表达增高.(2)miR-149可负调控细胞IL-6的表达水平.
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miR-149通过靶向FOXM1基因抑制前列腺癌细胞的生长和侵袭
目的：探讨miR-149对前列腺癌细胞生长和侵袭的影响，并研究miR-149的靶基因及其功能。方法：利用实时荧光定量PCR检测前列腺癌和癌旁组织miR-149和FOXM1 mRNA表达水平。在人前列腺癌细胞系PC3和DU145细胞中瞬时转染miR-149模拟物和阴性对照miRNA，运用平板克隆形成和Transwell侵袭实验检测细胞生长和侵袭。在细胞中分别转染miR-149靶基因FOXM1的siRNA和siRNA阴性对照，利用Western blot检测FOXM1蛋白表达情况，并检测细胞的克隆形成和侵袭能力。结果：在前列腺癌中miR-149低表达（P<0.01），FOXM1 mRNA高表达（P<0.01）。与对照组细胞相比，转染miR-149模拟物的PC3和DU145细胞克隆数目减少（P<0.01），发生侵袭的细胞减少（P<0.01）；FOXM1蛋白水平在转染miR-149模拟物的PC3（P<0.01）和DU145细胞（P<0.05）中较对照组细胞降低。转染FOXM1 siRNA的PC3和DU145细胞中FOXM1蛋白水平较对照组降低，且克隆形成和侵袭能力较对照组明显降低（P<0.01）。结论：miR-149通过靶向FOXM1抑制前列腺癌细胞生长和侵袭，发挥着抑癌基因的作用，可作为前列腺癌分子治疗的有效靶点。
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miR-149靶向抑制胰岛β细胞中FGF21表达对胰岛素分泌的影响及机制研究
[目的]探讨胰岛β细胞中miR-149对成纤维细胞生长因子21 (fibroblast growth factor 21,FGF21)靶向调控作用及抑制胰岛素分泌的作用机制,以期更好地了解糖尿病发病机制并为糖尿病诊断治疗提供新靶点.[方法]生物信息学预测靶向调控FGF21的miRNA;双荧光素酶报告基因检测实验验证靶向调节关系;qPCR检测大鼠胰岛素瘤细胞株(rat insulin-secreting betacell line,INS-1)胰岛β细胞中miR-149与FGF21 mRNA表达;应用酸醇提取INS-1胰岛β细胞中胰岛素,放射免疫法检测细胞内胰岛素含量;分别用5.6、16.7 mmol/L葡萄糖建立基础糖刺激胰岛素分泌模型(basal insulin secretion model,BIS)、高糖刺激胰岛素分泌模型(high glucose stimulates insulin secretion model,GSIS),放射免疫法测定各处理组胰岛素分泌量;western blotting检测INS-1胰岛β细胞中FGF21、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK的表达.[结果]MiR-149是潜在靶向调控FGF21的miRNA,其过表达可显著抑制FGF21荧光素酶活性,FGF21 3'URT中miR-149结合位点突变后荧光素酶活性恢复.过表达miR-149靶向抑制FGF21 mRNA与蛋白表达,进而降低INS-1细胞内胰岛素含量及分泌量,而外源过表达FGF21恢复了miR-149的抑制作用.MiR-149可靶向FGF21表达抑制其下游JNK、ERK信号通路活性.[结论]本研究揭示了在INS-1胰岛β细胞中,miR-149可通过直接靶向FGF21阻断其下游JNK、ERK信号通路抑制胰岛β细胞分泌胰岛素,进一步揭示了糖尿病发生发展恶化机制,为临床诊断治疗提供了新思路.
关键词： miR-149 大鼠胰岛素瘤细胞株 成纤维细胞生长因子21 胰岛素 糖尿病 -
中国广西人群miR-146 a、miR-149基因遗传多态性的研究
目的：研究广西人群miR-146a C＞G （rs2910164）、miR-149 T＞C（rs2292832）等位基因及基因型频率分布，分析其与不同民族种族间的差异性。方法：采用单碱基延伸技术和DNA测序技术对303例广西人群中miR-146a C＞G和miR-149 T＞C基因单核苷酸多态性（ SNP）位点进行分型检测，并与人类基因组计划（ Hapmap）数据库中公布的非洲人、欧洲人、日本人和中国北京人群的SNP分型数据比较。结果：miR-146a C＞G、miR-149 T＞C等位基因和基因型频率在广西男女人群之间分布均无差异性（P均＞0.05）。广西人群miR-146a C＞G和miR-149 T＞C基因型及等位基因频率与非洲人、欧洲人、中国北京人比较有统计学意义（P均＜0.05）。结论：广西人群miR-146a C＞G和miR-149 T＞C存在基因多态性，与其他种族人群比较有差异性，这种差异性对人类遗传病的研究可能会起到重要作用。
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结直肠腺癌组织中USP10的表达及生物信息学分析
目的 探讨泛素特异性蛋白酶10(Ubiquitin-specific protease 10,USP10)及其mRNA在人结直肠腺癌组织中的表达及意义,并分析表达失调的原因.方法 选取99例人结直肠腺癌及83例正常肠黏膜组织,采用组织芯片和免疫组化法检测USP10蛋白表达,并分析该蛋白表达与临床病理特征及患者预后生存的关系.采用GEO数据库分析USP10 mRNA表达水平.通过生物信息学法筛选出负性调控USP10蛋白表达的miRNA.采用免疫印迹及实时荧光定量PCR法分别检测不同肠癌细胞系中USP10蛋白和miR-149的表达.结果 USP10蛋白在正常肠黏膜组织中的阳性率为71.08％(59/83),明显高于肠腺癌组织(53.54％,53/99)(P=0.015).USP10蛋白表达与结直肠腺癌临床病理特征及患者预后生存无相关性(P＞0.05).USP10 mRNA在结直肠腺癌中的表达水平是正常肠黏膜组织的1.07 ～1.45倍,表明USP10蛋白表达下调发生在转录后水平.生物信息学分析显示,结直肠腺癌组织中呈高水平表达的miR-149与USP10 mRNA的3'UTR端具有高度保守的潜在结合位点,且肠癌细胞系中miR-149与USP10蛋白表达呈负相关.结论 USP10蛋白低水平表达与结直肠腺癌的发生密切相关,其表达下调主要发生在转录后水平,miR-149高水平表达可能是负性调控USP10蛋白表达的因子之一.
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人microRNA149抑制表达慢病毒载体的构建及对黑色素瘤细胞增殖及迁移的影响
目的 构建人microRNA149(Hsa-miR-149)抑制表达慢病毒载体,并探讨抑制miR-149表达对黑色素瘤Mel-RM细胞增殖及迁移的影响.方法 由miRBase及NCBI数据库查找获得miR-149序列,设计合成其引物序列,通过退火反应获得双链DNA寡核苷酸片段,与载体pBS-hU6-1连接,将连接后的载体与FG12连接,经测序鉴定后获得重组慢病毒载体;将重组慢病毒质粒分别与包装辅助质粒共转染至293T细胞中,包装产生病毒,进行病毒滴度测定,再用包装后的病毒感染Mel-RM细胞,利用实时荧光定量PCR法检测miR-149表达水平.同时用MTT法及细胞迁移实验分别检测细胞增殖和迁移能力.结果 成功构建了抑制miR-149表达的慢病毒载体,测序证实了所插入的基因序列正确.在荧光显微镜下观察到转染后的297T细胞表达大量绿色荧光蛋白,收集病毒,用梯度滴定法测得的重组载体病毒滴度为3.2×1010 TU/L.将病毒感染Mel-RM细胞显示可有效降低miR-149的表达水平(P＜0.05).MTT法结果显示与感染空载FG12病毒的对照组相比,感染抑制miR-149表达重组质粒的实验组中活细胞数明显减少(P＜0.05).细胞迁移实验结果显示与对照组相比实验组明显抑制了Mel-RM细胞的迁移(P ＜0.001).结论 成功构建抑制miR-149表达的慢病毒载体,抑制miR-149的表达可以抑制Mel-RM细胞的增殖和迁移.并为后续进一步研究miR-149对黑色素瘤细胞发生发展的影响提供依据.
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miR-149促进鼻咽癌细胞侵袭和上皮-间质转变
目的:探讨miR-149在鼻咽癌中的功能和机制.方法:Real-time PCR和2-△△Ct 计算方法验证miR-149在鼻咽癌细胞系中的表达,分别应用MTT实验、划痕实验和transwell迁移实验分析miR-149对鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭功能的影响.Western印迹检测E-cadherin的变化.结果:相对于正常鼻咽上皮细胞NP69,miR-149在5-8F和6-10B鼻咽癌细胞系中表达增高.MTT实验、划痕实验和transwell实验显示miR-149能够促进鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭.Western印迹证实miR-149能够降低E-cadherin的表达;反之,抑制miR-149能抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭转移能力.结论:miR-149通过调节细胞上皮-间质转变在鼻咽癌的侵袭转移中发挥重要作用.
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miR-149对人乳腺癌MCF-7细胞迁移和侵袭能力的影响
目的 探讨miR-149对乳腺癌细胞侵袭和转移能力的影响及其可能作用机制.方法 应用mi-Randa,TarBase v.5c靶基因预测网站分析miR-149与FOXM1 miRNA的可能结合位点,分别将miR-149模拟物(mimics),拮抗物(inhibitors)和无关序列转染到MCF-7细胞株,以空白转染组为阴性对照,用Western blot的方法比较各组细胞FOXM1蛋白的表达,用Transwell侵袭小室检测各组细胞侵袭能力的变化.结果 Western blot结果显示,miR-149 mimics转染组的MCF-7细胞中FOXM1蛋白表达较其余各组显著降低(均P ＜0.05),Transwell侵袭小室检测结果表明,miR-149 mimics转染组的细胞侵袭细胞数明显多于其余各组(均P ＜0.05).结论 miR-149能促进乳腺癌细胞侵袭和转移,其机制可能与抑制FOXM1的表达有关.
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MicroRNA-149对肺鳞状细胞癌转移能力的 影响及分子机制研究
目的 研究microRNA-149(miR-149)在肺鳞状细胞癌(LSCC)的临床意义及其对细胞迁移和侵袭的作用.方法 选取2010年1月-2015年12月西南医科大学附属医院收治的60例LSCC患者的癌灶及癌旁组织.采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-149在LSCC及癌旁组织中的表达.通过转染miR-149模拟物升高LSCC细胞系NCI-H226中miR-149的表达,划痕愈合试验检测过表达miR-149对NCI-H226细胞迁移的影响,Transwell小室探究miR-149对NCI-H226侵袭的影响.qRT-PCR及Western Blot检测miR-149过表达对NCI-H226细胞中叉头盒蛋白M1(FOXM1)及其靶基因基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达的影响.结果 miR-149在LSCC中表达水平低于癌旁组织(P<0.05);过表达miR-149能够降低NCI-H226细胞的迁移及侵袭能力(P<0.05).过表达miR-149能够下调其下游靶点FOXM1 mRNA和蛋白表达水平,抑制FOXM1靶基因MMP-2的表达(P<0.05).结论 miR-149在LSCC中呈低表达,miR-149通过抑制FOXM1/MMP-2信号通路来抑制LSCC的细胞转移能力.
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miR-149-5p在肝细胞癌中的表达及其临床意义
目的 分析miR-149-5p在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织中的表达及其临床意义.方法 应用qRT-PCR方法检测40对HCC癌组织和癌旁肝组织中miR-149-5p的表达,并分析miR-149-5p的表达与肝癌患者临床病理之间的关系,进一步将以红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)为报告基因的miR-149-5p慢病毒(LV-miR-149-5p)感染MHCC97-H肝癌细胞,以过表达miR-149-5p,采用MTT检测感染后细胞增殖的变化,采用流式细胞仪测定感染后细胞周期的变化,并采用Transwell侵袭实验检测感染后细胞的体外侵袭能力的变化.结果 qRT-PCR结果提示miR-149-5p在HCC癌组织中的相对含量(5.522±1.104)低于癌旁肝组织(9.279±1.594)(P＜0.05),统计分析表明miR-149-5p在癌和癌旁肝组织中相对含量的比值与AFP含量负相关(P＜0.05).体外实验证实,miR-149-5p过表达不能影响细胞周期但能抑制细胞增殖(P＜0.05),而在Transwell侵袭实验中,LV-miR-149-5p感染MHCC97-H细胞后,对照细胞组透膜细胞数为(86.3±11.8)/视野,对照慢病毒组透膜细胞数为(83.7±4.0)/视野,LV-miR-149-5p组透膜细胞数为(50.6±3.4)/视野,实验组细胞侵袭能力较对照组细胞显著降低(P＜0.05).结论 miR-149-5p的过表达可抑制MHCC97-H细胞的增殖和侵袭,因此,miR-149-5p可作为一种抑癌基因在HCC的诊断及治疗中发挥作用.
关键词： miR-149-5p miR-149 肝癌 肝细胞癌 -
陕西省汉族人群miR-149基因多态性与缺血性脑卒中相关性研究
目的 探讨陕西省汉族人群miR-149基因多态性的分布情况及其与缺血性脑卒中(isehemic stroke,IS)的关系.方法 缺血性脑卒中组357例,对照组373例,应用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性方法进行基因分型.比较各基因型和等位基因频率分布及其与缺血性脑卒中的关系.结果 受试者携带CC基因型比携带TT基因型[(OR(95 ％CI):1.739(1.088～2.781),P=0.020]患IS的风险要高.或至少携带一个C等位基因的受试者比携带T等位基因的受试者更易患IS[OR(95％CI):1.243(1.003～1.539),P=0.046].CC基因型患者血浆叶酸水平低于TT基因型患者.结论 在汉族人群中,microRNA-149 C＞T单核苷酸多态性与缺血性脑卒中有关.
