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三种可注射水凝胶促进大鼠缺血下肢微血管再生对比研究
目的 通过制备PLGA-PEG-PLGA温敏性水凝胶、海藻酸钠-壳聚糖复合水凝胶和slanc自组装多肽水凝胶,探讨大鼠下肢肌肉注射水凝胶对微血管再生的作用,为应用水凝胶材料治疗缺血性疾病提供新的策略和理论依据.方法 制备出可注射型PLGA-PEG-PLGA温敏性水凝胶、海藻酸钠-壳聚糖温敏复合水凝胶和slanc自组装多肽水凝胶.SD雄性大鼠随机分为PLGA-PEG-PLGA组(PPP组)、海藻酸钠-壳聚糖组(SA-CS组)、slanc组、PBS对照组及正常对照组.前四组建立雄性大鼠急性下肢缺血模型,缺血24 h后,下肢肌肉多点注射1.0 ml上述四种溶液;正常对照组行假手术处理.分别于4周、8周后,取各组大鼠下肢腓肠肌做组织切片.免疫组化检测CD31,检测各组大鼠的微血管密度,评价三种水凝胶对大鼠下肢微血管再生作用效果.结果 各组内比较,8周时,三种水凝胶组大鼠血管密度比4周时有所增加(P＜0.05).4周时,与PBS对照组比较,PPP组微血管密度未见明显增加(8.67±1.66比7.33±1.66),P＞0.05),SA-CS组(15.33±3.64)及slanc组(13.78±2.99)微血管密度增加(P＜0.05).8周时,与PBS对照组(8.72±1.36)比较,PPP组(14.39±1.33)、SA-CS组(23.33±2.11)及slanc组(18.61±1.72)微血管密度明显增加(P＜0.05),其中SA-CS组微血管密度增加多(P＜0.05).结论 设计合成的三种水凝胶都具有一定促进血管再生的能力,其中海藻酸钠-壳聚糖复合水凝胶促进血管再生功能为明显,在组织工程修复、器官组织再生、缺血性疾病治疗方面有潜在临床应用价值.
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BMSCs在功能化自组装多肽水凝胶中定向分化神经细胞研究
目的：探讨骨髓基质干细胞（ BMSCs ）在功能化自组装多肽水凝胶中定向分化为神经细胞及分化后细胞的功能特征。方法：制备功能化自组装多肽水凝胶，分别将BMSCs接种于RADA16自组装多肽水凝胶（对照组）与功能化自组装多肽水凝胶（实验组）表面，观察细胞迁移情况。用预诱导剂bFGF和EGF及定向诱导剂（SHH＋RA）时序诱导，应用Nestin、MAP2、GFAP、ChAT和VAT染色，比较分化后神经样细胞的形态和功能标志的差异。结果：BMSCs在功能化自组装多肽水凝胶中共培养及诱导剂的特定组合和时序的诱导下增殖分化呈现神经元细胞样改变，MAP2阳性细胞百分率较对照组显著提高（P＜0．05），GFAP 阳性细胞百分率较对照组显著降低（P＜0．05），且功能标志ChAT和VAT只在实验组表达。结论：BMSCs在功能化自组装多肽水凝胶中能定向诱导分化为具有功能的神经细胞。
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促血管内皮细胞生长的功能化自组装多肽框架材料的筛选和制备
背景:功能化多肽框架材料由于良好的生物相容性及生物活性,可以用来促进血管生成的研究.目的:设计并筛选出能够促进内皮细胞血管生成的功能化多肽框架材料.方法:将设计和筛选出的功能多肽片断通过固相合成法复合在自组装多肽RADA16-I的C末端,将RADA16-I与功能化自主装多肽以1∶1的比例混合,加入无菌培养板在37 ℃下孵育过夜以促进其凝胶,通过换培养基调节pH值.在凝胶上对内皮细胞进行2D培养.观察功能化自组装多肽框架材料的圆二色谱、原子力显微镜照像,内皮细胞黏附、增殖情况.结果与结论:功能化自组装多肽框架材料与Matrigel的形貌相似且是均一的纳米纤维材料.其中RAD/KLT和RAD/PRG具有促进内皮细胞黏附及增殖的功能.表明,功能化多肽框架材料RAD/KLT和RAD/PRG具有用于促内皮细胞血管生成的进一步研究的潜力.
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自组装多肽纳米纤维水凝胶在细胞三维培养中的应用及特征
背景：自组装多肽类材料因其独特的设计及良好的生物相容性和可降解性在众多三维支架材料中脱颖而出。目的：综述RADA类离子互补型自组装多肽支架材料的结构和功能化设计，从细胞三维培养方面探讨多肽类材料作为细胞载体材料在细胞治疗中的应用前景。
方法：由作者通过PubMed、Web of science数据库及CNKI数据库检索有关自组装多肽水凝胶的相关文献，检索词为“self-assembly peptide, tissue engineering；自组装多肽，组织工程”，检索文献量总计224篇，纳入包含多肽材料设计、功能化多肽材料、多肽材料用于细胞三维培养方面的研究，终纳入48篇。
结果与结论：从物理结构角度讲，多肽材料可以在生理环境中自组装成具有纳米级纤维和较高孔隙率的水凝胶，大程度上模拟细胞外基质的结构，保障细胞生存在一个真正的三维环境中。从生物功能角度讲，多肽材料可以根据不同需求复合特异性的生物活性短肽片断，赋予材料一定的细胞特异性，可以促进细胞的黏附、增殖或分化。 -
自组装多肽在生物医药领域的研究进展
自组装多肽可利用分子间非共价键作用力自发或触发自组装,形成有序的纳米结构,表现出单个多肽分子或低级分子聚集体所没有的独特特性与功能,近年来该领域已成为分子自组装研究的热点之一.根据自组装是否受外界环境的调控将其分为自发型和触发型两种类型,详细介绍了自组装多肽的分类以及其在生物医药领域中的应用前景,包括作为抗肿瘤药物及抗生素药物;作为药物载体改善药物的性质,实现药物靶向性;以及在细胞培养支架、组织修复、生物医学检测等方面的应用.
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自组装多肽凝胶联合可降解神经导管修复长节段周围神经损伤
[目的]探讨自组装多肽凝胶联合可降解神经导管修复长节段周围神经损伤的可行性及效果.[方法]选取新西兰大白兔48只,体重1500g左右,雌雄不限,按随机数字法分为A:自体神经移植组、B:神经导管+NSCs+ NGF组、C:神经导管+IKVAV多肽凝胶+NSCs+ NGF组；选取兔坐骨神经,暴露后人为造成10 mm缺损损伤,按照分组分别进行移植修复.术后3、6、9、12周观察兔下肢溃疡形成及愈合情况；术后12周对各组动物进行坐骨神经肌电图检查,处死后取标本观察神经再生情况、小腿三头肌湿重、组织学观察及神经干细胞存活情况.[结果]术后3组动物均出现不同程度的足底溃疡,恢复情况以A组好,C组次之,B组差.术后12周神经肌电图、肌肉湿重检测均显示自体神经移植组神经功能恢复良好,优于其余两组(P＜0.05).组织学观察显示C组神经再生情况接近自体神经移植组,明显优于B组.术后12周荧光显微镜下观察到在神经损伤处有绿色荧光蛋白(GFP)荧光表达,神经干细胞仍然存活.[结论]自组装多肽凝胶联合可降解神经导管修复长节段周围神经损伤可以取得良好的疗效.
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自组袭多肽纳米支架与骨髓间充质干细胞的生物相容性研究
[目的]合成神经活性多肽IKVAV(isoleucine-lysine-valine-alanine-valine,异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸)两亲性分子,在体外进行自组装纳米纤维支架,并检测其与骨髓间充质干细胞( mesenchymal stem cells,MSCs)的生物相容性.[方法]IKVAV多肽两亲性分子委托上海波泰生物科技公司合成,并用高效液相色谱仪和质谱仪进行纯化和分析.将IKVAV多肽两亲性分子溶于0.1 M NaOH溶液中,加入稀盐酸降低pH值引发自组装,并利用透射电镜进行观察.分离兔骨髓间充质干细胞,流式分析其表面抗原标志.将MSCs与自组装支架体外共培养12 d,测定细胞粘附率,MTT方法检测IKVAV自组装材料对细胞生长增殖的影响,观察其生物相容性. [结果]IKVAV-PA可在一定条件下自组装形成凝胶,透射电镜可见其显示为纳米纤维,其直径为7.0～8.0 nm.分离的MSCs细胞表面标志CD105、CD44、CD34和CD45的阳性率分别为99.3％、99.5％、0.1％、0.4％.共培养过程后,随着时间延长,MSCs在多肽凝胶支架上黏附率上升,吸光度增加,细胞活性增强.[结论]IKVAV-PA能自组装形成纳米纤维凝胶,具有良好的生物相容性和生物活性.
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自组装多肽与神经生长因子导管修复兔周围神经缺损
[目的]探索自组装多肽凝胶复合神经生长因子(NGF)的神经导管修复周围神经损伤的可行性及效果.[方法]以静电纺丝技术制备单纯聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)和PLGA复合NGF的纳米纤维复合神经导管,制备“异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸”(IKVAV)顺序的自组装多肽凝胶.选取新西兰大白兔72只,制备兔坐骨神经10mm缺损模型.按随机数字法分为4组,每组18只,分别给予以下处理:A组自体神经移植,B组单纯PLGA神经导管+NGF桥接,C组单纯PLGA神经导管+IKVAV多肽凝胶+NGF桥接、D组复合NGF的PLGA导管+IKVAV多肽凝胶桥接.术后1、2、3个月行电生理检测、大体观察、小腿三头肌湿重恢复率测量和组织学检查.[结果]术后复合NGF导管逐渐吸水膨胀并降解,周围组织未见明显炎性反应,无神经卡压.术后1个月,再生神经已通过缺损,但直径细小,随着时间延长逐渐增粗.各组间比较发现,D组神经再生效果接近A组,各项指标优于B组(P＜0.05),部分指标优于C组(P＜0.05).D组和A组之间比较,差异无统计学意义(P＞0.05),但小腿三头肌湿重恢复率较A组稍差.[结论]自组装多肽凝胶联合复合神经生长因子的神经导管具有良好的组织相容性,能够有效促进神经生长,效果接近自体神经移植.
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人脑源性神经营养因子基因修饰的大鼠骨髓间质干细胞与自组装多肽水凝胶的生物相容性
目的 探讨人脑源性神经营养因子(hBDNF)基因修饰的大鼠骨髓间质干细胞(rMSCs)在自组装多肽水凝胶中的生物相容性.方法 前期的研究中我们成功了构建重组腺病毒介导以hBDNF为目的基因、增强型绿色荧光蛋白为标志基因的大鼠骨髓间质干细胞(hBDNF-rMSCs).本研究中我们将hBDNF-rMSCs分别与不同水凝胶共培养,实验分组:hBDNF-rMSCs+完全培养基(对照组);hBDNF-rMSCs+RADA16水凝胶组(RADA16多肽组);hBDNF-rMSCs+RADA16-PRG水凝胶组(RADA16-PRG多肽组);溴脱氧尿嘧啶核苷(BMU)掺入法测共培养后1、3、5d细胞增殖水平;噻唑蓝(MTT)法测共培养后1、3、5d细胞代谢活性.结果 与对照组比较,不同时点的hBDNF-rMSCs在RADA16-PRG水凝胶中的细胞BrdU掺入率及细胞代谢率显著性增加(细胞BrdU掺入率Pd1=0.000,Pd3 =0.001,Pd5=0.000;细胞代谢率Pd1=0.002,Pd3 =0.019,Pd5 =0.001),不同时点hBDNF-rMSCs在RADA16水凝胶中的细胞BrdU掺入率及细胞代谢率差异无统计学意义(细胞BrdU掺入率Pd1 =0.138,Pd3=0.063,Pd5 =0.137;细胞代谢率Pd1 =0.240,Pd3=0.078,Pd5=0.054);与RADA16水凝胶组比较,不同时点的hBDNF-rMSCs在RADA16-PRG水凝胶中的细胞BrdU掺入率及细胞代谢率显著性增加(细胞BrdU掺入率Pd1=0.002,Pd3 =0.004,Pd5=0.000;细胞代谢率Pa1=0.002,Pd3 =0.019,Pd5=0.004).结论 hBDNF基因修饰rMSCs与自组装多肽RADA16及功能化RADA16-PRG水凝胶具有良好的生物相容性,hBDNF-rMSCs在功能化RADA16-PRG自组装水凝胶中具有更高的细胞增殖及代谢水平.
关键词： 人脑源性神经营养因子 骨髓间质干细胞 自组装多肽 水凝胶 生物相容性 -
功能化自组装多肽水凝胶支架促进小鼠骨髓间充质干细胞的粘附、增殖及成骨
目的 探讨功能化自组装纳米多肽DGEAmx水凝胶对小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的粘附、增殖和成骨分化的影响.方法 原子力显微镜观察功能化自组装多肽形成的纳米级结构特征;用倒置显微镜对贴壁细胞拍照计数,对比细胞粘附情况;用CCK-8法检测细胞增殖;激光共聚焦显微镜观察细胞在材料表面形貌;检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、成骨分化特异性基因Ⅰ型胶原(ICAM-1)和骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)的表达来评价成骨效果.结果 原子力显微镜观察功能化自组装多肽DGEAmx可以形成纳米纤维网状结构;倒置显微镜对贴壁细胞拍照计数结果显示在30、60、90 min时DGEAmx组对比RADA16-Ⅰ组粘附细胞数差异有统计学意义(P＜0.05);CCK-8法检测结果显示在培养第3、5、7天,DGEAmx组MSCs增殖较RADA16-Ⅰ组明显增高(P＜0.05);DGEAmx组成骨诱导3、7、14 d后,ALP活性高于RADA16-Ⅰ组(P＜0.05);Real-time PCR结果显示成骨诱导3、7、14 d后DGEAmx组较RADA16-Ⅰ组有更高的ICAM-1和OCN的表达(P＜0.05).结论 功能化自组装多肽DGEAmx纳米纤维水凝胶支架能促进MSCs粘附、增殖和成骨分化,作为骨组织工程支架材料有良好的应用潜力.
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修饰有BMP-7功能片段的功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶RADKPS制备及其生物相容性研究
目的 制备并评价载有BMP-7功能片段的新型功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料RADKPS的生物相容性,为其在退变髓核再生领域中的体内研究提供实验依据.方法 以自组装多肽RADA16-Ⅰ为原料,通过化学键链接BMP-7功能片段构建功能化自组装多肽RADA-KPSS,再与RADA16-Ⅰ等比例混合制备新型功能化自组装多肽RADKPS.通过大体观察、原子力显微镜评估RADKPS支架材料的结构特点.分离培养3月龄新西兰大白兔BMSCs,取第3代BMSCs与RADKPS复合培养7d,通过扫描电镜、细胞荧光素二乙酸盐/碘化丙啶活性染色、MTT法检测RADKPS的细胞相容性;于6月龄新西兰大白兔离体椎间盘内注射1％RADKPS后培养并观察其髓核内细胞活性.采用溶血实验检测RADKPS的血液相容性.将RADKPS植入6～8周龄昆明小鼠皮下28 d,行大体观察及HE染色观察RADKPS组织相容性.结果 RADKPS在L-DMEM中成胶后呈均匀透明水凝胶状;原子力学显微镜示纳米纤维相互连接呈三维网状结构,纤维直径(25.68±4.62) nm,纤维长度(512.42±32.22)nm.RADKPS支架复合BMSCs 7 d后,扫描电镜示细胞在支架上黏附良好,细胞活性维持在90％以上;MTT检测示0.1％、0.05％、0.025％RADKPS溶液均不同程度促进新西兰大白兔BMSCs增殖.溶血实验结果示,不同浓度RADKPS溶液相对溶血率均＜5％,符合医用生物材料的溶血实验要求.小鼠皮下注射实验结果示,28 d后注射局部皮肤无水疱、红斑及焦痂形成;HE染色示淋巴细胞等炎性细胞浸润,大量纤维组织取代水凝胶支架,材料组织相容性良好.结论 新型功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料RADKPS具有良好的生物相容性和安全性,适合于髓核的组织工程修复与再生研究.
