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人脑源性神经营养因子基因修饰BMSCs联合EPO治疗大鼠急性脊髓损伤中的作用及机制
目的 观察人脑源性神经营养因子(hBDNF)基因修饰的间充质干细胞(BMSCs)在促红细胞生成素(EPO)治疗急性脊髓损伤中的治疗作用及其机制.方法 通过病毒转染hBDNF基因到BMSCs后,将80只脊髓损伤模型SD大鼠,随机分为4组:NS组(在脊髓损伤前1 d经腹腔注射相同量的生理盐水)、EPO组(在脊髓损伤前按照5000 U/kg给予EPO)、联合组(脊髓损伤前给予5000 U/kg EPO,损伤后在受损脊髓中点及受损中点上下5 mm中注入BDNF基因转染的BMSCs各5μl)和BDNF/BMSC组(脊髓损伤前腹腔给予等量生理盐水,在脊髓损伤后在脊髓中注入20μl BDNF基因转染BMSCs).采用BBB法进行运动能力评分,PCR以及Western-blot法对脊髓BDNF基因及蛋白进行定量分析.结果 较其他3组,联合组在脊髓损伤(SCI)早期与晚期对运动能力恢复效果为明显,联合组在7 d、14 d、21 d、28 d BDNF mRNA与蛋白表达水平均高于其他3组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 BDNF基因修饰的BMSC移植联合EPO治疗可促进大鼠脊髓损伤后神经功能的修复,这可能与促进脊髓损伤处BDNF的表达有关.
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重组腺病毒Ad5-hBDNF-EGFP的构建及体外转染大鼠间充质干细胞后基因表达
目的:构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因为标志基因、人脑源性神经营养因子(hBDNF)基因为目的基因的重组腺病毒Ad5-hBDNF-EGFP,体外转染大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs),探讨转染效率及转染基因的表达情况.方法:构建穿梭质粒pDC316- hBDNF-mCMV- EGFP；利用AdMax包装系统,穿梭质粒与骨架质粒共转染293细胞,同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒Ad5-hBDNF- EGFP,经反复感染293细胞扩增病毒.SD大鼠骨髓,体外分离、培养rMSCs,流式细胞仪检测rMSCs表面标记物；不同感染复数( MOI)的重组腺病毒转染第3代rMSCs,检测转染率及hBDNF蛋白的表达变化.结果:PCR、酶切鉴定及测序证实穿梭质粒和重组腺病毒载体成功构建.rMSCs流式细胞仪检测CD34、CD45阴性表达,CD9、CD90阳性表达.腺病毒体外转染rMSCs后荧光显微镜下可见绿色荧光信号表达,免疫印迹法检测出hBDNF蛋白的表达；绿色荧光表达强度、转染率及hBDNF蛋白的表达水平均随着腺病毒MOI的增加而增加,佳MOI为100.结论:体外成功构建Ad5-hBD-NF-EGFP,并能有效转染rMSCs,成功获取基因工程干细胞,hBDNF及EGFP基因均可在该细胞中得到有效表达.
关键词： 腺病毒载体 人脑源性神经营养因子 增强型绿色荧光蛋白 骨髓间充质干细胞 基因修饰 -
人脑源性神经营养因子cDNA克隆及在酵母中的表达
目的:克隆和表达人脑源性神经营养因子(hBDNF).方法和结果:从原代培养人雪旺细胞中提取总RNA,用RT-PCR法获取了编码带前导肽的和成熟的hBDNF 2个cDNA片段,经DNA测序表明其顺序与文献报道一致.将这2个cDNA片段分别插入到大肠-酵母穿梭质粒pVT102U/α上.用酵母整体细胞法将重组质粒转化酵母宿主细胞,经筛选后,获得分泌性表达.表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定,大小都在15 000左右.将这2种部分纯化的BDNF样品经鼠胚背根神经节生物活性分析,表明具有明显的促进细胞存活和突起生长的作用.结论:hBDNF能在酿酒酵母系统获得有生物活性的表达.
关键词： 人脑源性神经营养因子 基因表达 酿酒酵母 -
人脑源性神经营养因子基因修饰的大鼠骨髓间质干细胞与自组装多肽水凝胶的生物相容性
目的 探讨人脑源性神经营养因子(hBDNF)基因修饰的大鼠骨髓间质干细胞(rMSCs)在自组装多肽水凝胶中的生物相容性.方法 前期的研究中我们成功了构建重组腺病毒介导以hBDNF为目的基因、增强型绿色荧光蛋白为标志基因的大鼠骨髓间质干细胞(hBDNF-rMSCs).本研究中我们将hBDNF-rMSCs分别与不同水凝胶共培养,实验分组:hBDNF-rMSCs+完全培养基(对照组);hBDNF-rMSCs+RADA16水凝胶组(RADA16多肽组);hBDNF-rMSCs+RADA16-PRG水凝胶组(RADA16-PRG多肽组);溴脱氧尿嘧啶核苷(BMU)掺入法测共培养后1、3、5d细胞增殖水平;噻唑蓝(MTT)法测共培养后1、3、5d细胞代谢活性.结果 与对照组比较,不同时点的hBDNF-rMSCs在RADA16-PRG水凝胶中的细胞BrdU掺入率及细胞代谢率显著性增加(细胞BrdU掺入率Pd1=0.000,Pd3 =0.001,Pd5=0.000;细胞代谢率Pd1=0.002,Pd3 =0.019,Pd5 =0.001),不同时点hBDNF-rMSCs在RADA16水凝胶中的细胞BrdU掺入率及细胞代谢率差异无统计学意义(细胞BrdU掺入率Pd1 =0.138,Pd3=0.063,Pd5 =0.137;细胞代谢率Pd1 =0.240,Pd3=0.078,Pd5=0.054);与RADA16水凝胶组比较,不同时点的hBDNF-rMSCs在RADA16-PRG水凝胶中的细胞BrdU掺入率及细胞代谢率显著性增加(细胞BrdU掺入率Pd1=0.002,Pd3 =0.004,Pd5=0.000;细胞代谢率Pa1=0.002,Pd3 =0.019,Pd5=0.004).结论 hBDNF基因修饰rMSCs与自组装多肽RADA16及功能化RADA16-PRG水凝胶具有良好的生物相容性,hBDNF-rMSCs在功能化RADA16-PRG自组装水凝胶中具有更高的细胞增殖及代谢水平.
关键词： 人脑源性神经营养因子 骨髓间质干细胞 自组装多肽 水凝胶 生物相容性 -
构建含人脑源性神经营养因子基因的逆转录表达载体及其在成纤维细胞中的表达
目的 构建含有人脑源性神经营养因子(human brain-derived neurotrophic factor,hBDNF)的逆转录病毒载体pLXSN(hBDNF-pLXSN),鉴定hBDNF生物活性.方法 提取自愿捐献5月龄胎儿脑组织基因组mRNA,应用RT-PCR技术获得hBDNF基因序列,体外构建hBDNF-pLXSN感染的成纤维细胞NIH/3T3.对其进行病毒滴度检测,采用免疫组织化学染色鉴定NIH/3T3细胞中hBDNF的表达.通过对PC12细胞和大鼠背根神经节的培养,分析hBDNF生物学活性.结果 测序结果表明成功构建了hBDNF-pLXSN.被感染的NIH/3T3细胞免疫组织化学染色显示胞浆中有hBDNF表达.hBDNF-pLXSN具有促进PC12细胞增殖的作用,并可以使培养的背根神经节长出神经突.结论 hBDNF-pLXSN病毒可以感染NIH/3T3细胞并使其表达和分泌具有生物学活性的hBDNF,可以作为面瘫基因治疗研究的工具.
关键词： 人脑源性神经营养因子 基因转染 成纤维细胞 逆转录病毒 -
人脑源性神经营养因子基因修饰神经干细胞移植对痴呆大鼠学习记忆的改善
目的观察神经干细胞(neural stem cell,NSC)和人脑源性神经营养因子(human brain derived neurotrophic factor, hBDNF)基因修饰NSC移植对阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)模型鼠的学习记忆改善作用. 方法 SD大鼠40只随机分为4组,每组10只.Ⅰ组为正常对照组;其余3组进行单侧切断大鼠穹窿海马伞(fibria-fornix,FF) 制备AD模型,Ⅱ组为损伤组;Ⅲ、Ⅳ组于术后10～12 d,侧脑室移植hBDNF基因修饰及未修饰的NSC分别为NSC组和BDNF组.移植后2周进行Morris水迷宫定位航行及空间探索行为学检测. 结果Ⅲ组和Ⅳ组的平均逃避潜伏期为41.84±21.76 s和25.23±17.06 s,较Ⅱ组潜伏期70.91±23.67 s明显缩短,差异有统计学意义(P<0.01);平台象限游泳距离占总游泳距离的百分比:Ⅲ组和Ⅳ组分别为36.9%和42.0%, 较Ⅱ组26.0%明显增高,差异有统计学意义(P<0.01);Ⅱ组大鼠采取边缘式和随机式搜索模式显著多于其它各组,差异有统计学意义(P<0.01).其中Ⅳ组大鼠的平均逃避潜伏期和平台象限游泳距离百分比及搜索策略接近Ⅰ组(P>0.05),采取直线式和趋向式的搜索策略显著多于其它各组(P<0.01). 结论 NSC和hBDNF基因修饰NSC移植对AD模型鼠的行为学有不同程度的改善, hBDNF基因修饰NSC移植较单独NSC移植疗效好.
关键词： 人脑源性神经营养因子 神经干细胞 基因修饰 阿尔茨海默病 大鼠 -
人脑源性神经营养因子重组腺伴随病毒的制备
目的构建并产生人脑源性神经营养因子(human brain-derived neurotrophic factor, hBDNF)重组腺伴随病毒(adeno-associated virus, AAV)载体.方法将目的基因hBDNF插入载体质粒pSSHG-Neo的EcoRI-BamHI位点,构建重组质粒pSSHG-Neo/hBDNF.用腺病毒辅助质粒pFG140代替野生型腺病毒,包装质粒pAAV/Ad及已构建的重组质粒,三质粒磷酸钙共沉淀法转染80%融合的143细胞系,包装AAV-hBDNF.经蔗糖梯度离心法纯化、斑点杂交方法测定重组病毒滴度.结果重组病毒AAV-hBDNF滴度约为4.86×1014颗粒*L-1.结论成功制备了重组病毒AAV-hBDNF,为神经退行性疾病基因治疗实验奠定了基础.
关键词： 人脑源性神经营养因子 腺伴随病毒 磷酸钙共沉淀法 斑点杂交
