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产气荚膜梭菌检验标准的修订
GB 4789.13--2012《食品安全国家标准 食品卫生微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》已经颁布实施,文章就该标准的修订部分及修订原因进行详细说明,包括样品制备、选择性计数琼脂的选择、活菌计数培养、确证实验和菌数计算等方面.
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产气荚膜梭菌选择性显色培养基的研制
目的 通过筛选各种选择性成分添加至培养基中以快速筛选产气荚膜梭菌,研制产气荚膜梭菌选择性显色培养基.方法 通过单因素试验评价促生长因子甘露醇、丙酮酸钠、硫酸镁对目标菌生长的促进作用,比较抗生素环丝氨酸、新霉素、多粘菌素和磺胺嘧啶对目标菌和非目标菌的抑制作用,比较显色剂5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸二钠盐(BCIP)、对硝基苯磷酸二钠(PNPP)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-Gal)、4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃糖苷(Mu-Gal)、邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)对目标菌的显色效果,将酶促因子硫酸镁、硫酸钙、硫酸锰、硫酸锌与目标菌反应筛选佳成分并确定其用量,制成产气荚膜梭菌选择性显色培养基.结果 筛选出的培养基佳成分促生长因子为丙酮酸钠,用量200rg,抗生素环丝氨酸0.5rg,显色剂为BCIP和Mu-Gal,用量均为6mg,酶促因子硫酸镁72mg,以上成分加入到100ml营养肉汤基础培养基中,制备的选择性培养基培养效果与TSC培养基、SPS培养基无差异.结论 本实验所研制的选择性培养基可以用于产气荚膜梭菌的检测.
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郑州市熟肉制品中产气荚膜梭菌污染状况调查
目的 了解郑州市熟肉制品中产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的污染状况,为熟肉制品储存过程中产气荚膜梭菌的安全控制提供技术支撑.方法 按照GB 4789.13-2012《食品安全国家标准食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验》中的方法分别对11种不同样品进行检测分析,结合VITEK鉴定法和分子生物学鉴定法进一步验证.结果 259份样品中,产气荚膜梭菌检出份数为38份,总检出率14.7％,不同样品的检出率范围为0.0％～33.3％,其中盐焗鸡样品检出率高为33.3％ (7/21),卤半片鸭和卤鸡肝样品未检出.烧鸡、烤鸡和卤鸡腿样品的产气荚膜梭菌菌落总数均超过5.0log10CFU/g,其他样品的菌落总数均在4log10～5 log10CFU/g之间.结论 郑州市熟肉制品中的产气荚膜梭菌污染现象较严重,烧鸡、烤鸡和卤鸡腿的菌落总数较高,有引起食物中毒的可能.
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从一起疑似产气荚膜梭菌食源性疾病暴发调查反思实验室依赖的病因筛查思路
目的 调查一起急性胃肠炎暴发的原因,并对当前基层疾病预防控制机构在食源性疾病暴发流行病学调查中有关样品和标本采集后,致病因子的筛查思路进行了分析探讨.方法 制定病例定义,开展病例搜索和个案调查,采用描述性流行病学方法 分析事件特征;开展病例对照研究探讨危险因素和现场卫生学调查追溯原因.采集病例标本和环境样品进行致病菌分离.结果 共搜索病例43例,临床表现主要以腹泻(100.0％,43/43)、腹痛(93.0％,40/43)、恶心(32.6％,14/43)等为主.流行曲线符合点源暴发模式,可疑餐次为2013年9月12日午餐,病例对照研究结果 提示烧鸭为可疑食物(OR =4.0,95％ CI为1.04～15.23).共采集各类样品和标本36份,在13份病例肛拭子中分离培养出产气荚膜梭菌5份,阳性率为38.5％.结论 该事件为一起疑似产气荚膜梭菌食源性疾病暴发,可能危险因素为烧鸭烤熟后在室温下长时间(约5～6h)缓慢冷却后受污染,且未经重新加热直接进食所致.建议加强对餐饮机构厨师的监督管理,防止类似事件再次发生.基层流行病学调查人员应摒弃“实验室依赖”的惯性思维,加强对各种致病因子“症状流行病学”知识的归纳总结,以降低在各种食源性疾病暴发中,因不熟悉疾病临床特征而导致的误判和漏栓.
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过氧乙酸对矿泉水卫生指标菌杀灭效果的试验观察
目的 观察过氧乙酸消毒液对天然矿泉水卫生指标菌的杀菌效果.方法 采用悬液定量杀菌方法进行了实验室观察.结果 用浓度为100 mg/L的过氧乙酸消毒液对悬液内铜绿假单胞菌、粪链球菌和产气荚膜梭菌作用3 min,或用200 mg/L过氧乙酸作用1 min,杀灭对数值均>5.0,即可达到完全杀灭.结论 较低浓度的过氧乙酸消毒液可快速杀灭悬液内铜绿假单胞菌、粪链球菌、产气荚膜梭菌,达到对天然矿泉水卫生标准中新增三种指标菌消毒要求.
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2016年北京市食源性疾病暴发事件流行病学特征分析
目的 分析2016年北京市食源性疾病暴发事件的流行病学特征,为制订食源性疾病预防控制措施提供依据.方法 通过“国家食源性疾病暴发监测系统”收集2016年食源性疾病暴发事件数据,应用SPSS19.0对数据进行统计分析,采用描述性流行病学方法进行分析.结果 2016年北京市共报告食源性疾病暴发事件36起,发病299例,无死亡病例.6月为暴发事件发生高峰,责任单位主要为集体食堂.在查明致病因素25起事件中,细菌为主要致病因素,其次为扁豆中毒,并首次发现由产气荚膜梭菌引起的暴发事件.结论 细菌和扁豆中毒为北京食源性疾病暴发事件主要致病因素,应加强相关食源性疾病的健康宣教,并加强实验室能力建设,提高致病因素识别能力.
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一起大型活动中票务人员聚集性腹泻事件调查研究
本研究对一起大型国际田径锦标赛期间场内票务工作人员聚集性腹泻事件进行流行病学调查,查找致病因子、传播途径和感染来源,为大型活动中的公共卫生保障工作机制和工作模式提供案例与参考.采用现场流行病学调查方法,搜索病例、了解发病情况和可疑感染途径,采集并检测食物、患者粪便等样本,进行34种肠道病原体的分子生物学检测.结果显示,该起疫情共发现病例49例,均为某票务公司票务工作人员,罹患率为20.85％ (49/235),发病高峰为2015年8月27日01:00至08:00.南部检票口的病例数多于北部.腹泻、腹痛为主要症状.2份病例粪便样本产气荚膜梭菌特异性基因阳性.本次聚集性腹泻事件的可能病原体为产气荚膜梭菌,可能的感染途径是集中进食被产气荚膜梭菌污染并保存不当的食品.大型活动组织中,应加强食品安全监管、建立食源性疾病监测预警系统、对场内人群进行健康监测.
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肠道梭菌在腹泻发生及治疗中的作用机理
梭菌是肠道一大类兼性厌氧细菌,与许多疾病息息相关.其中艰难梭菌和产气荚膜梭菌主要通过产生毒素和气体诱发腹泻.临床主要通过酪酸梭菌、普拉梭菌等益生菌、梭菌疫苗、抗生素以及粪菌移植等手段抑制有害梭菌的增殖,恢复肠道菌群平衡治疗梭菌感染性腹泻.本文主要阐述肠道梭菌对腹泻机理的影响和治疗作用,为探索肠道梭菌感染性腹泻的治疗提供研究思路.
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型特异性多重PCR快速检测创伤组织中的产气荚膜梭菌
目的 为快速检测创伤组织中的产气英膜梭菌建立型特异性多重PCR方法.方法 建立菌落和含产气荚膜梭菌创伤标本中的染色体和质粒DNA简便、快速纯化[月桂基硫酸三乙胺醇(TLS)法]和型特异性多重PCR方法;对各型产气荚膜梭菌、部分近缘梭菌标准株和开放性创伤气性坏疽标本进行PCR检测,其结果与培养结果进行比较.结果 该方法可检测各型产气荚膜梭菌,并可排除近缘梭菌干扰;A型株检测灵敏度达到7.5×10~3/ml;可在5 h内获取结果;标本PCR检测与培养结果相符.结论 新建立的培养和创伤组织标本中产气荚膜梭菌染色体与质粒DNA纯化方法简便、快速;型特异性多重PCR具有良好的特异性、较高的灵敏度,短时间内获得结果,可用于临床实验室.
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产气荚膜梭菌实时荧光定量PCR方法的应用
目的 利用荧光定量PCR技术,建立快速敏感特异的产气荚膜梭菌检测方法.方法 以产气荚膜梭菌基因作为靶序列,设计一对引物和探针,以产气荚膜梭菌菌株提取核酸DNA作为模板,优化引物和探针的浓度比,同时验证方法的灵敏度、特异性、重复性.结果 反应体系在上、下游引物浓度均为1 μmol/L,探针浓度为0.1 μmol/L时,具有良好的特异性和灵敏度,与创伤弧菌等24种相关细菌均无交叉反应,对纯菌检测的灵敏度为9×102 CFU/ml,重复性试验证实该体系重复性好,稳定性高;3例临床样本检测结果与细菌培养结果相符.结论 建立的实时荧光PCR方法特异、灵敏、快速,能对临床气性坏疽做出快速准确的报告,实现对气性坏疽战时高发性疾病安全、快速和定量检测.
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应用多重PCR鉴定对人致病的产气荚膜梭菌毒素
目的 研究用多重PCR的方法鉴定产气荚膜梭菌及分型毒素,为开展基因诊断做好准备. 方法 根据GenBank已经发表的产气荚膜梭菌毒素基因序列,设计出针对CPα、CPβ、CPE毒素基因的3对特异引物,运用多重PCR的方法鉴定出产气荚膜梭菌并对其毒素基因进行分型. 结果 经电泳鉴定,多重PCR成功的扩增出预先设计的3条特异的目的条带. 结论 所设计的多重PCR反应体系能够得到产气荚膜梭菌的特异序列,同时能够鉴定分型3种对人致病的毒素序列,为进一步开展基因诊断打下基础.
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利用groupⅡintron构建产气荚膜梭菌突变体
目的 通过插入失活α毒素基因获得产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)突变体.方法 利用Mobile groupⅡintron的自我剪切作用,对本室保藏的1株野生型C.perfringens的α基因plc插入失活.通过菌落PCR检测,以及观察突变株在哥伦比亚血琼脂培养基和脑心浸液培养基(4%卵黄)平板上的形态变化,进行阳性筛选.蛋白质免疫印迹分析α毒素蛋白活性.结果 PCR检测到α毒素突变体的plc基因中,存在Mobile groupⅡintron片段,并且观察到该菌在哥伦比亚鲜血琼脂平板培养基上的α毒素溶血环消失,在脑心浸液培养基(4%卵黄)平板上无白晕.蛋白质免疫印迹分析表明,plc突变体不表达α毒素蛋白.结论 成功构建C.perfringens α毒素突变体,为后期探索C.perfringens口服疫苗打下了重要基础.
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产气荚膜梭菌引起进行性肌坏死1例
2003年2月,一患者因外伤入院,肢体大部分离断, 梭状芽孢杆菌感染后出现进行性肌坏死,后经截肢、药物治疗,痊愈出院.现报告如下:1 病历摘要患者,男,30岁,2003年2月6日晚入院,患者于2月6日上午在工作中不慎右膝部被机器扭转致伤,肢体大部分离断,只有部分皮肤相连,畸形,小腿呈紫色,足趾苍白发凉.
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产气荚膜梭菌α毒素亚单位基因的表达及表达产物活性分析
含有产气荚膜梭菌α毒素基因序列的克隆载体pMD18TCα,经BamHⅠ和HindⅢ内切酶双酶切后,将α毒素亚单位基因亚克隆到原核表达载体pET30b中,构建表达载体pET30bPα.经酶切和测序鉴定,α毒素基因中的900 bp的片段正确插入到表达载体中.重组菌株BL21(DE3)pET30bPα经IPTG诱导的表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析,表达出大小为38×103的重组蛋白具有和α毒素阳性血清发生特异性的免疫反应.
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真空包装即食鸡肉中检出1株产气荚膜梭菌的报告
产气荚膜梭菌又称魏氏梭菌,是一种专性厌氧菌,其A型能引起人的食物中毒.中毒多发生在夏、秋季节,中毒食品包括生畜肉、禽肉、鱼、牛奶及其他蛋白性食品.在食品行业中,熟食制品采用真空包装非常普遍,客观上为厌氧菌的生长提供了条件.2003年4月,我们从2份真空包装即食鸡肉中检出同1株产气荚膜梭菌.
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酪酸梭菌与婴儿型双歧杆菌对产气荚膜梭菌试管内生物拮抗作用的研究
用酪酸梭菌(Clostridiumbutyricum)和婴儿型双歧杆菌(BifidobacteriumInfantis)对产气荚膜梭菌(Clostriduimperfringens)进行试管内的生物拮抗试验.将酪酸梭菌、婴儿型双歧杆菌及酪酸梭菌和婴儿型双歧杆菌分别对产气荚膜梭菌以一定的比例等量混合接种于GAM液体培养基中进行厌氧培养.实验证明酪酸梭菌和婴儿型双歧杆菌能明显抑制产气荚膜梭菌的生长,并且比各自单独培养时显示了较强的生物拮抗作用.
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产气荚膜梭菌α-β2-β1融合基因的构建及表达
目的 构建产气荚膜梭菌α-β2-β1融合蛋白基因表达载体,并对表达产物进行鉴定.方法 利用PCR技术,从含α毒素基因的质粒pXCPA02中扩增出α毒素基因,经NcoⅠ酶切,回收0.95kb的α基因片段,再与经NcoⅠ酶切并含融合基因β1-β2的质粒pXETB1B2连接,获得重组质粒pXETAB2B1,经Nco Ⅰ、BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切鉴定,并对其表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析.结果 重组质粒pXETAB2B1含有α-β2-β1融合基因.表达产物相对分子质量约为95 000,并可被特异性抗体识别.结论 已获得高效表达α-β2-β1的重组菌株.
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产气荚膜梭菌β2-β1融合基因的构建及初步表达
目的构建产气荚膜梭菌β2-β1毒素融合基因并在重组大肠杆菌中表达.方法采用PCR方法,从含β2毒素基因质粒CPB2-9中扩增出β2毒素基因,经Nco Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后,回收0.73 kb片段,再将含β1毒素基因质粒pXETB1经同样双酶切回收,与β2片段连接,转化BL21(DE3)中,进行诱导表达.结果经SDS-PAGE和Western blot分析表明,重组菌株BL21(DE3)可表达β2-β1融合蛋白,且该蛋白可以被相应的抗体所识别.结论已成功构建了β2-β1融合基因,并在重组大肠杆菌中表达.
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C型产气荚膜梭菌保护性抗原的免疫原性
目的 研究C型产气荚膜梭菌α-β2-β1融合基因重组工程菌BL21(DE3)/pXETAB281抗原的免疫原性.方法 在对重组工程菌BL21(DE3)/pXETAB2B1进行优化表达的基础上,制备包涵体粗提物、全细胞培养物及全细胞乳糖诱导培养物3种抗原,对ICR小鼠进行攻毒保护试验.结果 重组工程菌BL21(DE3)/pXETAB2B1能够表达α-β2-β1融合蛋白,该融合蛋白能够有效刺激免疫小鼠产生特异性抗体,达到保护的目的.结论 已获得具有一定免疫原性的重组工程菌,可作为预防产气荚膜梭菌所引起疾病的候选菌株.
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牛产气荚膜梭菌α-ε毒素基因的融合表达及其纯化
目的 融合表达产气荚膜梭菌α毒素基因和ε毒素基因的融合基因α-ε,并进行纯化.方法 利用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌C57-8株基因组DNA中扩增出α毒素基因的部分基因片段,插入到质粒pET28a-ε上,构建含α-ε融合毒素基因的表达质粒pET28a-α-ε,转化至E coli BL21(DE3)plysS感受态细胞中,IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化后,进行Western blot鉴定.结果 重组质粒pET28a-α-ε经PCR及双酶切鉴定证明构建正确,与预期的基因序列重合率为99％.表达的重组蛋白相对分子质量约78 000,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的22.7％,纯度为91.2％,可与小鼠产气荚膜梭菌多抗血清特异性结合,具有良好的反应原性.结论 成功构建了重组质粒pET28a-α-ε,并在E coli BL21(DE3)plysS中表达了重组α-ε融合蛋白,该蛋白具有良好的反应原性,可作为预防牛肠毒血症基因工程亚单位疫苗的候选抗原.
