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产气荚膜梭菌α毒素基因片段克隆的测序与应用
目的：为了获得A型产气荚膜梭菌C57株α毒素基因片段克隆质粒，作为实时定量PCR检测标本产气荚膜梭菌标准，以备临床应用。方法采用两轮高保真 PCR扩增 A 型产气荚膜梭菌 C57株α毒素基因片段（Cpa900），经EcoRⅠ酶切后插入质粒pUC19并连接，构建重组质粒pUC19-Cpa900，转化大肠埃希菌Top10感受态菌株并予以增菌后测序，并提取质粒进行实时定量PCR测试。结果 pUC19下游引物匹配Cpa900上、下游引物双PCR筛选电泳结果表明，116-2株中含单拷贝、反向插入pUC19的Cpa900，并为测序结果所证实；测序结果表明，克隆片段与美国典型菌种保藏中心标准株ATCC 13124的全基因序列CP000246．1中的磷脂酶C（PLC）基因（CPF_0042）相应序列相比，符合率高达99．8％；变异位点不在两实时定量PCR引物和探针区，经实时定量PCR实测对扩增效率无影响，完全可用作实时定量PCR检测标准。结论 A型产气荚膜梭菌α毒素克隆片段序列高度保守，作为模板具有高扩增效率，可作为标准品用于实时定量PCR检测 A型产气荚膜梭菌，质粒引物匹配插入片段双引物双PCR筛选转化菌株，不但可鉴定阳性克隆，还能确定重组质粒中插入基因拷贝数量和插入方向、有效避免假阳性，不失为很好的筛选方法。
关键词： 产气荚膜梭菌A型 α毒素 克隆 测序 实时定量聚合酶链反应 -
利用groupⅡintron构建产气荚膜梭菌突变体
目的 通过插入失活α毒素基因获得产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)突变体.方法 利用Mobile groupⅡintron的自我剪切作用,对本室保藏的1株野生型C.perfringens的α基因plc插入失活.通过菌落PCR检测,以及观察突变株在哥伦比亚血琼脂培养基和脑心浸液培养基(4%卵黄)平板上的形态变化,进行阳性筛选.蛋白质免疫印迹分析α毒素蛋白活性.结果 PCR检测到α毒素突变体的plc基因中,存在Mobile groupⅡintron片段,并且观察到该菌在哥伦比亚鲜血琼脂平板培养基上的α毒素溶血环消失,在脑心浸液培养基(4%卵黄)平板上无白晕.蛋白质免疫印迹分析表明,plc突变体不表达α毒素蛋白.结论 成功构建C.perfringens α毒素突变体,为后期探索C.perfringens口服疫苗打下了重要基础.
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A型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆及高效表达
目的:实现产气荚膜梭菌α毒素(Clostridium perfringens alpha toxin,CPa)基因的克隆与表达.方法:用PCR技术从A型产气荚膜梭菌中扩增出CPa基因,克隆到原核表达载体pQE30中,构建了重组质粒pQE30-CPa,转化E.coli M15获得了CPa的高效表达.结果:序列测定和双酶切表明,CPa基因正确插入载体.序列分析发现CPa基因与GenBank中的4种CPa基因相似率为76.7%～99.9%.工程菌裂解液经SDS-PAGE分析显示在相对分子质量43?000处有一条表达很强的蛋白区带,与CPa相对分子质量相符,约占菌体总蛋白的62.88%,主要以包涵体形式存在.免疫印迹结果表明, 表达的重组CPa蛋白同抗CPa血清有特异性结合.结论:为进一步研究CPa重组疫苗和制备CPa的特异性抗体奠定了基础.
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产气荚膜梭菌α毒素亚单位基因的表达及表达产物活性分析
含有产气荚膜梭菌α毒素基因序列的克隆载体pMD18TCα,经BamHⅠ和HindⅢ内切酶双酶切后,将α毒素亚单位基因亚克隆到原核表达载体pET30b中,构建表达载体pET30bPα.经酶切和测序鉴定,α毒素基因中的900 bp的片段正确插入到表达载体中.重组菌株BL21(DE3)pET30bPα经IPTG诱导的表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析,表达出大小为38×103的重组蛋白具有和α毒素阳性血清发生特异性的免疫反应.
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金黄色葡萄球菌α毒素对肺水通道蛋白表达的影响
目的:观察金黄色葡萄球菌α毒素(α-toxin)对Balb/c小鼠肺微血管内皮细胞(LMEC)水通道蛋白1(AQP1)表达的影响.方法:将实验组小鼠15只腹腔注入α-toxin后根据6 h、10 h、24 h取材时间,随机将它们分为α-toxin 6 h组、α-toxin 10 h组和α-toxin 24 h组.取左肺行病理HE染色和免疫组化染色,检测肺组织病理变化情况和AQP1表达的变化.结果:α-toxin各组肺泡间隔增宽、水肿,炎性细胞浸润,肺泡结构破坏,以α-toxin 10 h组为明显.免疫组化α-toxin各组AQP1表达下降(P＜0.05).其中以α-toxin 10 h组为明显.α-toxin 6 h组和α-toxin 10 h组及α-toxin 10h组和α-toxin 24 h组均有显著性差异(P＜0.05).结论:AQP1表达于LMEC.金葡菌α毒素可致小鼠肺LMEC的AQP1表达下降,随着炎症的减轻,AQP1也随之表达增加,进而恢复正常.
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UV诱变对金葡菌生产α毒素的影响
紫外线照射是基因诱变的因素之一.不同波长、不同照射时间会使细胞DNA发生不同的变异,其结果会给子代带来不同的个体性状;相同诱变条件,由于个体差异,变异结果也不同.[1,2]
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产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆表达和生物学活性的鉴定
目的利用原核表达系统表达具有生物学活性的产气荚膜梭菌α毒素.方法设计针对α毒素基因的一对引物,用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增出α毒素的全基因.经测序确认正确后,回收的α毒素目的条带与pGEX6p-1表达载体经限制性内切酶Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后,进行连接,转化大肠杆菌BL21.诱导表达后,做SDS-PAGE电泳,出现特异的表达产物条带.表达产物做溶血活性、卵磷脂水解活性和腹腔接种小鼠实验.结果构建的重组质粒经内切酶Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后,发现特异的目的基因条带.SDS-PAGE电泳后,发现重组菌株有特异的表达条带.实验证明表达产物具有溶血活性、卵磷脂水解活性和腹腔接种后致死小鼠特性.结论重组菌株BL21(pGEX6p-1-cpα)表达了具有活性的α毒素蛋白.
