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苹果多糖预防小鼠结肠炎癌变的作用及其机制研究
目的 研究苹果多糖对小鼠结肠炎癌变的预防作用,并探讨其作用机制.方法 从苹果渣中提取苹果多糖,使用致炎剂葡聚糖硫酸钠(DSS)和致癌剂氧化偶氮甲烷(AOM),建立小鼠结肠炎相关结直肠癌动物模型.通过免疫组织化学、蛋白质印迹法、酶联免疫分析等方法观察苹果多糖预防用药对各组小鼠血清中促炎细胞因子肿瘤坏死因子(TNF)-α以及组织TLR4/MyD88/NF-κB p65通路的影响.结果 苹果多糖预防用药20周后,与模型组(95％致癌率)相比,苹果多糖(1.25％、2.5％和5％)将结直肠肿瘤的发生率降至26％、10％、5％.蛋白质印迹法结果显示,苹果多糖各个剂量组均降低结直肠组织中TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白表达.酶联免疫分析结果显示,苹果多糖各剂量组小鼠血清中肿瘤坏死因子-α水平明显降低(P＜0.05).结论 苹果多糖可有效预防结肠炎癌变,其作用机制可能与其抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路有关.
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白藜芦醇抑制软骨肉瘤细胞SW1353炎症反应的实验研究
目的:探讨白藜芦醇(RES)对白细胞介素1β(IL-1β)处理的人软骨肉瘤细胞SW1353的效应及其可能机制.方法:采用CCK-8法测定不同浓度IL-1β及RES对SW1353细胞增殖活力的影响.ELISA法检测细胞培养基上清基质金属蛋白酶13(MMP-13)的水平.RT-PCR法检测Toll样受体4(TLR4)、TIR结构域接头分子(TRIF)、髓样分化蛋白88(MyD88)mRNA表达.结果:IL-1β处理对SW1353细胞的增殖活力无明显抑制作用(P>0.05).RES浓度为6.25、12.5 μmol·L-1时能促进细胞增殖(P<0.05).RES浓度在50 μmol·L-1时对细胞增殖无明显作用(P>0.05),而RES浓度为200 μmol·L-1时则显著抑制细胞增殖(P<0.05).IL-1β和RES联合处理与单纯RES处理比较,能够降低细胞增殖活力(P<0.05).相比对照组,IL-1β处理组培养基上清中MMP-13分泌水平及TLR4、TRIF、MyD88 mRNA表达均明显增加(P<0.01),而RES则能够显著抑制IL-1β诱导的MMP-13的分泌水平,并降低TLR4、TRIF、MyD88 mRNA的表达(P<0.01).结论:RES可以通过抑制TLR4信号通路对体外培养的SW1353细胞发挥抗骨性关节炎效应.
关键词： 软骨内瘤细胞 白藜芦醇 Toll样受体4 TIR结构域接头分子 髓样分化蛋白88 -
αGVHD小鼠靶器官组织TLR4/MyD88/NF-κB信号通路蛋白表达变化及意义
目的 探讨异基因骨髓移植(allo-BMT)后急性移植物抗宿主病(aGVHD)小鼠模型靶器官组织中Toll样受体4(TLR4)/髓样分化蛋白88(MyD88)/核转录因子κB(NF-κB)信号通路蛋白表达变化及意义.方法 以C57BL/6雄性小鼠和BALB/c雌性小鼠为allo-BMT的供、受鼠,受鼠接受白舒非+环磷酰胺方案致死剂量预处理后,输注供鼠来源骨髓细胞及脾脏淋巴细胞,建立aGVHD模型(aGVHD组).以BALB/c雄性小鼠和BALB/c雌性小鼠为同基因骨髓移植(Syn-BMT)的供、受鼠,受鼠经等剂量药物预处理后输注供鼠来源骨髓细胞,建立Syn-BMT模型为对照(Syn-BMT组).移植后第14天,两组分别取5只存活小鼠,处死后取肝、肠、脾及皮肤组织,分别采用实时荧光定量PCR、Western blotting及免疫组化法检测各组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65、NF-κB p50 mRNA及蛋白相对表达量、蛋白阳性表达率.结果 aGVHD组肝、肠、脾和皮肤组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65、NF-κB p50 mRNA相对表达量及蛋白相对表达量、蛋白阳性表达率均较Syn-BMT对照组增加(P均<0.05).结论 aGVHD模型小鼠肝、肠、脾和皮肤组织中TLR4/MyD88/NF-κB信号通路蛋白在基因水平和蛋白水平均表达上调.TLR4/MyD88/NF-κB信号通路可能参与了allo-BMT后aGVHD的发病过程.
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TLR4通路关键蛋白MyD88在坏死性小肠结肠炎发病过程中的作用机制研究
目的 探究以MyD88为关键传导分子的TLR4下游炎症-凋亡信号通路在NEC发病过程中的作用机制.方法 采用SPF级,新生10日龄MyD88-/-幼鼠和相应的野生型幼鼠,共32只,分别按照数字表法随机分配进入NEC实验组或对照组;NEC实验组幼鼠置入自制新生保育箱内造模处理(每日人工配置鼠乳代用品喂养,5次/d;每次给予N2缺氧90 s后,快速充入O2复氧,再次置入4℃环境冷刺激10 min,3次/d,连续3 d;LPS 10mg/kg稀释于0.1 ml灭菌水中,去芯留置针头口腔插管灌胃,1次/d,连续3 d);对照组继续与母鼠同笼,鼠乳喂养.实验结束后取材回肠末端肠管组织,HE染色法组织病理评分及液相芯片细胞因子TNF-α及IL-1β检测判断各组肠道NEC炎症程度.TUNEL方法检测各组小鼠肠道细胞的凋亡水平变化.实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测各组小肠组织内TLR4炎症-凋亡通路中TRIF、IRF-3、NF-κb、Bax、Bcl-2、Caspases的mRNA表达情况.结果 与野生鼠NEC组相比,MyD88敲除鼠小肠炎症程度评分(1.63±0.52比2.75±0.46)、炎症效应分子NF-κb表达(1.38±0.25比2.33±0.76)、促炎因子IL-1β(465.57±81.59比863.58±198.28)、TNF-α(5.41±0.83比6.48±1.15)水平明显降低;肠上皮细胞凋亡明显减少(4.44±0.47比9.75±1.00),凋亡效应分子Caspases 8(2.03±0.20比4.06±0.44)、Caspases 9 (1.02±0.08比1.93±0.09)、Caspases 3(1.87±0.28比6.75±1.12)和促凋亡基因Bax(1.15±0.25比2.40±0.42)表达降低(P＜0.05).MyD88非依赖通路中关键因子TRIF(1.85±0.38比1.4±0.19)和IRF-3(2.01±0.41比1.53±0.38)表达上调(P＜0.05);抗凋亡基因Bcl-2(1.18±0.31比1.10±0.20)表达无变化(P＞0.05).结论 ①TLR4下游的MyD88-NF-κb信号通路是NEC发病过程中重要的炎症-凋亡调控机制;①MyD88在NEC发生过程中介导了Caspase 8-外源性及Caspase 9-内源性凋亡信号通路的激活过程;②MyD88敲除后,MyD88依赖性信号通路被阻断,MyD88非依赖通路被激活,NEC炎症程度及肠上皮细胞凋亡明显降低.
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白藜芦醇通过TLR4/MyD88依赖性信号通路对SW1353细胞发挥抗骨关节炎作用的实验研究
目的 探讨白藜芦醇(resveratrol,RES)通过抑制TLR4/MyD88依赖性信号通路发挥抗白细胞介素1β(interleukin -1β,IL-1β)诱导的SW1353细胞骨关节炎(osteoarthritis,OA)作用. 方法 3-(4,5-二甲基吡啶-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑盐法[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium,inner salt,MTS]测定RES(0～ 100 μmol/L)及IL-1β(10 ng/ml)对SW1353细胞增殖活力的影响.采用RES(12.5、50 μmol/L)处理经IL-1β(10 ng/ml)诱导的细胞,ELISA法检测培养基上清中白细胞介素6(IL-6)水平,Western blot法检测软骨细胞Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)、髓样分化蛋白88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)蛋白表达. 结果 IL-1β(10 ng/ml)对细胞增殖活力无明显影响,RES(3.125 ～ 25 μmol/L)可显著增强细胞活力(P＜0.05),RES(100 μmol/L)可显著抑制细胞活力(P＜0.05).IL-1β可显著增加培养基上清IL-6水平(P＜0.05),且具有时间依赖性;同时IL-1β也可显著增加软骨细胞TLR4及MyD88的蛋白表达(P＜0.05).RES处理可显著降低培养基上清IL-6水平(P＜0.05)及软骨细胞的TLR4及MyD88的蛋白表达(P＜0.05). 结论 RES可能通过抑制TLR4/MyD88依赖性信号通路发挥抗IL-1β诱导的SW1353细胞的OA效应,在OA的防治方面有潜在的应用前景.
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地塞米松对巨噬细胞信号转导接头蛋白MyD88的抑制作用
目的 研究地塞米松对马尔尼菲青霉固有免疫反应中巨噬细胞信号转导接头蛋白MyD88的作用.方法 马尔尼菲青霉酵母相菌液与小鼠腹腔巨噬细胞共培养,应用地塞米松作用后采用ELISA法测定培养液上清中TNF-α的浓度:Real time PCR及Western blot法检测MyD88的蛋白及基因表达.结果 地寨米松抑制被马尔尼菲青霉激活的巨噬细胞产生TNF-α,并抑制巨噬细胞接头蛋白MyD88的蛋白及mRNA的表达.结论 地塞米松对马尔尼菲青霉固有免疫反应抑制作用与其对MyD88的抑制相关.
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肠隐窝上皮细胞Myd88稳定沉默体外模型的建立及早期凋亡研究
肠道炎症性疾病临床常见,发病率逐年上升而病因不清.现已证实Toll样受体4(TLR4)信号通路与肠道炎性疾病密切相关.髓样分化蛋白88(Myd88)是TLR4炎症信号通路上游关键调控点,对肠道炎性疾病的研究具有重要价值,但目前尚缺乏Myd88稳定调控表达的体外模型.本实验利用慢病毒三质粒包装系统,构建特异靶向Myd88基因RNA干扰(RNAi)病毒载体.采用改良病毒离心法结合离心孵育法(MVC-S)行肠隐窝上皮细胞(IEC-6)转导,采用Real-time PCR及Western blot检测Myd88 mRNA及蛋白水平,Annexin V染色、流式细胞术检测Myd88沉默后对IEC-6细胞早期凋亡影响.结果显示正确构建的慢病毒shRNA载体,可通过改良MVC-S法成功转导IEC-6细胞,转导后的IEC-6细胞Myd88表达明显下调,同时早期凋亡减少.本实验成功构建了慢病毒载体介导的RNAi的Myd88稳定沉默细胞系,并总结分享了实验中的关键技术条件及要点,同时描述了沉默Myd88后IEC-6细胞早期凋亡明显减少的特征,为肠道炎性疾病的发病机制及靶向治疗研究提供了一个新的、稳定的、可重复的细胞模型.
