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基因工程在L-色氨酸生产中的应用研究进展
尽管L-色氨酸的生产已取得诸多进展,但由于其合成代谢途径长、调控复杂,故一直未能达到工业化生产的要求.本文主要概述近年来通过构建色氨酸合成酶和色氨酸酶基因工程菌株与酶法相结合来生产L-色氨酸方面的进展及其局限性,并从增加前体物质代谢流、限速酶量和消除途径抑制因素等方面着重论述第三代基因工程--代谢工程在L-色氨酸生产方面的研究状况,指出代谢工程育种为今后色氨酸育种的主要方向.
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洋金花叶化学成分研究(Ⅰ)
目的 研究洋金花Datura metel叶的化学成分.方法 应用乙醇提取洋金花叶,采用硅胶、AB-8大孔吸附树脂、ODS和Sephadex LH-20等柱色谱以及制备液相等技术分离纯化化合物,根据理化性质及波谱数据进行结构鉴定.结果 从洋金花叶中分离得到14个化合物,分别鉴定为naphthisoxazol A(1)、刺龙芽糖苷Ⅰ(2)、L-色氨酸(3)、槲皮素3-O-2-(E-咖啡酸)-α-L-阿拉伯糖-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖-7.O-β-D-葡萄糖苷(4)、正丁基-O-α-D-呋喃果糖苷(5)、金线莲碱(6)、二氢催吐萝芙木醇-O-β-D-葡萄糖苷(7)、(6S,7E,9S)-9-[(β-D-glucopyranosyl)-oxy] megastigma-4,7-dien-3-one (8)、山柰酚-3,7-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(9)、山柰酚-7-O-β-D-葡萄糖苷(10)、槲皮素-7-O-葡萄糖苷(11)、(6S,9R)-6-羟基-3-酮-α-紫罗兰醇-9-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(12)、豆甾醇(13)、豆甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷(14).结论 化合物1～8为首次从茄科中分离得到.
关键词： 洋金花叶 刺龙芽糖苷Ⅰ L-色氨酸 正丁基-O-α-D-呋喃果糖苷 金线莲碱 -
翅果油树叶的化学成分研究
目的 对翅果油树Elaeagnus mollis叶的化学成分进行研究.方法 利用硅胶柱色谱,Sephadex LH-20柱色谱和制备高效液相色谱等手段进行分离纯化,根据理化性质和波谱数据对化合物进行结构鉴定.结果 从翅果油树叶70％乙醇提取物中分离得到16个化合物,分别鉴定为山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(1)、山柰酚-3-O-(6"-O-反式对香豆酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(2)、山柰酚-3-O-(6"-O-顺式对香豆酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(3)、槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(4)、山柰酚-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(5)、山柰酚-3,7-O-α-L-二吡喃鼠李糖苷(6)、山柰酚-3-O-β-D-吡比喃半乳糖-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(7)、山柰酚-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(8)、hippophamide (9)、L-色氨酸(10)、阿江榄仁酸(11)、熊果酸(12)、山柰酚(13)、芦丁(14)、腺苷(15)、β-胡萝卜苷(16).结论 化合物3～10、15均为首次从胡颓子属植物中分离得到;1、2、11、12为首次从翅果油植物中分离得到.
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色氨酸及其衍生物对海南粗榧悬浮细胞合成三尖杉酯类碱的影响
目的 研究L-色氨酸及其衍生物5-甲基-DL-色氨酸(5-MT)对海南粗榧悬浮细胞生长及三尖杉酯类碱合成的影响.方法 在细胞培养第15天,向海南粗榧悬浮培养物中添加一定量的L-色氨酸或5-MT,测定细胞生长、产物量以及代谢途径中关键酶的活力.结果 L-色氨酸与5-MT都能促进三尖杉酯类碱的合成.添加5 mg/L 5-MT时,产物量高(2.944 mg/L);添加10 mg/LL-色氨酸和5 mg/L 5-MT后,三尖杉酯类碱产量分别是对照(1.343 mg/L)的1.947、2.192倍;而悬浮细胞生物量分别比对照(2.406 g/L)降低了9.35％、18.04％.同时,3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶活性分别比对照(0.67 U/mg)降低了12.4％、5.57％;苯丙氨酸解氨酶活性分别比对照(78.21 U/mg)增加了37.72％、28.02％;酚类物质积累比对照(0.36 mg/mL)增加了19.14％、9.61％.结论 L-色氨酸及其衍生物5-MT能抑制代谢支路,促进代谢流向产物三尖杉酯类碱的方向.
关键词： 海南粗榧 悬浮培养 L-色氨酸 5-甲基-DL-色氨酸 三尖杉酯类碱 -
基因修饰后树突状细胞吲哚胺2,3二氧化酶表达变化及其对T细胞增殖的影响
背景:研究表明,吲哚胺2,3二氧化酶的表达可以降低机体的免疫应答反应,保护细胞和组织移植物,参与同种异体移植免疫耐受.细胞毒T细胞相关抗原4可以抑制T细胞的活化,在维持周边免疫耐受的过程中起着关键性的作用,但其作用机制尚不清楚.目的:观察转染细胞毒T细胞相关抗原4基因前后树突状细胞上吲哚胺2,3二氧化酶表达水平及其活性对T淋巴细胞增殖的影响.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2005-09/2007-02在华中科技大学同济医学院附属协和医院普外科实验室和眼科实验室完成.材料:成年雌性Lewis大鼠和F344大鼠购自北京维通利华实验动物种子中心,体质量180～200 g.方法:采用脂质体转染的方法将质粒pG/细胞毒T细胞相关抗原4转入F344大鼠髓源性树突状细胞中,将转染前、转然后24,柏,72 h树突状细胞分为4组,反转录-聚合酶链反应检测转染前后骨髓源树突状细胞中吲哚胺2,3二氧化酶mRNA的表达,反相高效液相色谱法检测吲哚胺2,3二氧化酶活性.以Lewis大鼠T淋巴细胞为反应细胞,丝裂霉素C灭活的转染前后不同时间F344大鼠骨髓源树突状细胞为刺激细胞建立混合淋巴细胞培养体系.有或无L-色氨酸存在下,CCK8试剂盒检测T淋巴细胞增殖率,AnnexinV/PI双染色流式细胞仪检测T淋巴细胞凋亡.主要观察指标:①树突状细胞吲哚胺2,3二氧化酶mRNA的表达及吲哚胺2,3二氧化酶活性.②混合淋巴细胞培养CCK8及AnnexinV-FITC细胞凋亡检测结果.结果:转染细胞毒T细胞相关抗原4后树突状细胞中吲哚胺2,3二氧化酶的表达较转染前高(P＜0.01),且转染后48 h树突状细胞的吲哚胺2,3二氧化酶活性高(P＜0.01).高表达吲哚胺2,3二氧化酶的树突状细胞在体外能诱导同种异体T细胞凋亡,抑制T细胞增殖,混合淋巴细胞培养体系中加入L-色氨酸后T淋巴细胞的凋亡率明显下降(P＜0.01).结论:树突状细胞上的吲哚胺2,3二氧化酶表达水平与T淋巴细胞的增殖密切相关,树突状细胞在体外可能通过吲哚胺2,3二氧化酶活性发挥免疫抑制作用.
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重组大肠杆菌高密度发酵生产L一色氨酸
为提高重组大肠杆菌生产L-色氨酸的产量,减少乙酸和色素的生成,考察了比生长速率的梯度控制和溶氧的分阶段控制对生产L-色氨酸的影响.在确定了合适的工艺控制后,L-色氨酸的产量提高为41.8g/L,比工艺优化前提高了30％.
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从L-色氨酸制备D-色氨酸
L-色氨酸在碱性条件下消旋制得DL-色氨酸,以D-樟脑磺酸为手性拆分剂生成D-色氨酸樟脑磺酸盐,后经水解制得D-色氨酸,总收率约40％.
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搅拌调整对L-色氨酸发酵的影响
本试验采用25 L自动发酵罐,在保持其他因素不变的前提下,通过调整发酵罐搅拌来控制发酵液的溶氧浓度.通过测定发酵过程中的溶氧浓度、菌体浓度、乙酸生成量、质粒稳定性及L-色氨酸(1)合成量等指标,确定了适搅拌速度和搅拌桨大小.通过优化发酵搅拌条件,使得1的产量提高到了61.0 g/L.本研究为1的工业化生产优化提供了依据.
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色氨酸酶的催化功能及其在L-色氨酸酶法合成中的应用
色氨酸酶是一种依赖磷酸吡哆醛的多功能酶,由相同的4个亚基组成.每个亚基含有一个磷酸吡哆醛结合位点,催化活性需要NH4+或K+存在.它不仅能催化L-色氨酸的分解,而且能催化一系列α,β-消去反应和β-取代反应.其催化机制主要包括外部醛亚胺的形成和醌型中间物的生成.在高浓度底物条件下,色氨酸酶能催化丙酮酸、吲哚和氨合成L-色氨酸.通过β-取代反应,色氨酸酶催化L-丝氨酸、L-半胱氨酸合成L-色氨酸,这为酶法工业化生产L-色氨酸提供了重要途径.此外,色氨酸酶在制备硫醇类香料化合物中也发挥重要作用.
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以L-半胱氨酸和吲哚酶法合成L-色氨酸
用色氨酸酶基因工程菌WW-4催化L-半胱氨酸和吲哚合成L-色氨酸.80ml反应液(L-半胱氨酸0.75g,吲哚0.75g)37℃反应48h,可积累L-色氨酸1.18g.L-半胱氨酸转化率为93.2%,吲哚转化率为90.1%.产品总回收率达70%,所得晶体在熔点、旋光性和红外吸收光谱等方面与标准品完全一致.
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色氨酸酶基因工程菌的活力及其与表达关系研究
选择并改进了以L-色氨酸为底物测定吲哚的生成量作为色氨酸酶活力测定方法,应用改进的方法测定了7株工程菌色氨酸酶的活力,也对不同诱导时间色氨酸酶的表达与活力关系进行了比较.结果表明工程菌色氨酸酶的活力比宿主菌均有不同程度的提高,其中11号工程菌比宿主菌高16倍.诱导表达1h时酶活高,但酶活高低并不与其表达量呈平行关系.
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膜技术在酶法生产L-色氨酸中去除蛋白质和色素的应用研究
目的 用超滤-纳滤膜分离法去除L-色氨酸酶法转化液中的蛋白质和色素.方法 L-色氨酸转化液经适当处理后,输入超滤膜和纳滤膜设备,分别收集输出的清液和浓液,然后检测其透光率并用加入碱或乙醇方式,检查转化液中蛋白质、色素的去除效果.结果 在转化液pH调节至5.5 ～6.0、温度控制在20～25℃的膜分离工艺条件下,经超滤-纳滤输出的清液,加入碱或乙醇无蛋白质析出,透光率达85％以上,比使用活性炭脱色处理的滤液高2.7倍.结论 膜分离法去除转化液中蛋白质和色素的效果明显优于传统的絮凝剂沉淀蛋白质和活性炭脱除色素,从而为酶法生产L-色氨酸提供了一条绿色、先进的纯化工艺.
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LC-MS/MS法同时测定大鼠血浆中L-色氨酸和L-犬尿氨酸浓度的研究
本研究运用液相色谱-二级质谱连用技术,以3-硝基酪氨酸(3-NT)为内标,建立了可同时、快速测定大鼠血浆中L-色氨酸(L-Try)和L-犬尿氨酸(L-Kyn)的LC-MS/MS法,通过比较肝癌成模过程中L-Kyn和L-ry的变化来为肝癌的诊断提供理论依据.色谱条件:RRHD Eclipse Plus C18色谱柱(3.0mm×100 mm,1.8μm),以水-乙腈(含0.1％甲酸)(90∶ 10)为流动相洗脱,流速0.25 mL/min,进样量5μL.质谱条件:采用MRM模式进行定量检测,化合物质荷比分别为205.12→146.10(L-Try),209.09→146.10(L-Kyn),227.09→181.10(3-NT).结果显示:L-Try和L-Kyn的线性范围分别是9.670～9 670和9.973～9 973 ng/mL (r2≥0.999 0),L-Try和L-Kyn的定量限分别为9.670和9.973 ng/mL,日内、日间精密度均小于15％.整个分析物的回收率均大于81.17％,并没有表现出严重的基质效应,表明肝癌成模过程中大鼠血浆L-Kyn/L-Try比值呈现整体下降趋势.L-Kyn/L-Try比值的变化是肝肿瘤形成过程中一个非常明显的变化,可为药物代谢研究和肝癌机制研究发挥重要作用.该方法灵敏、快捷、准确,专一性强,可用于药物代谢的分析研究及药物对肝癌的作用机制研究.
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色氨酸酶基因工程菌酶法合成L-色氨酸
目的:以L-丝氨酸和吲哚为底物,用色氨酸酶基因工程菌酶法合成L-色氨酸.方法:以IPTG诱导工程菌色氨酸酶表达,将酶活高时的工程菌游离细胞作为转化反应的酶源,通过纸层析分析并测定转化液中L-色氨酸的含量.结果:100ml反应液(L-丝氨酸3g,吲哚3g)37℃反应48h可积累L-色氨酸4.9g,L-丝氨酸转化率为84.2%,吲哚转化率为93.6%.经分离纯化所得的L-色氨酸晶体,在熔点、旋光性和红外吸收光谱等方面与标准品完全一致.结论:色氨酸酶基因工程菌能有效地催化L-丝氨酸和吲哚合成L-色氨酸,进一步证明了该酶在L-色氨酸酶法合成中的可行性和有效性.
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L-色氨酸对四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化进程的改善作用
目的 观察L-色氨酸对四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化的作用.方法 雄性C57/BL6小鼠15只随机分成正常对照组、肝纤维化模型组和L-色氨酸干预组,8周后处死小鼠,留取肝脏和血清.天狼猩红染色(Sirius Red)以及羟脯氨酸测定观察肝纤维化的程度,同时测定血清或者肝脏中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和还原型谷胱甘肽(GSH)的含量.实时定量PCR法(RT-qPCR)测定肝脏组织中基质金属蛋白酶(MMPS)和基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)基因的表达.结果 实验期间各组小鼠平均体重和摄食量差异均无统计学意义.与肝纤维化模型组对比,L-色氨酸干预可以减少天狼猩红染色面积,降低羟脯氨酸含量;同时L-色氨酸可以上调MMP2、MMP13基因以及下调TIMP1基因的表达(P＜0.05),但是对TIMP2基因的表达无影响;可以显著降低血清ALT、增加肝脏组织中GSH的含量,但是对血清AST和肝组织中MDA、SOD的影响差异无统计学意义.结论 L-色氨酸可以提高肝脏抗氧化能力、减少细胞外基质(ECM)沉积来发挥改善肝纤维化的作用.
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稳定同位素标记的L-色氨酸
稳定同位素标记的L一色氨酸是核技术在氨基酸方面的应用.在合成方面,除有机合成和同位素交换法外,微生物法由于在全标记以及构型方面的优势,近年来也得到广泛应用;在应用方面,稳定同位素标记的色氨酸作为示踪剂,已被广泛用于医学、生物、化工等行业.随着蛋白质工程、分子生物学以及多肽等药物的发展,它将迎来更加美好的应用前景.
